[發明專利]含有富含亮氨酸重復序列的融合蛋白及其制法和應用

在審

• 申請號: 201310150884.4
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN104119445A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 李華順
• 申請（專利權）人: 李華順
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C12P21/02;C12P21/06
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;雷芳

技術領域

本發明涉及生物分子領域，尤其涉及含有富含亮氨酸重復序列的融合蛋白及其制法和應用。

背景技術

神經導向因子Slit是一種在進化上高度保守的分泌型細胞外基質糖蛋白，其基因在1988年發現在中樞神經系統的形成中發揮作用。Slit是一組相對分子質量為170-190kDa的細胞外分泌蛋白，對軸突生長和神經元遷移起導向作用的軸突定向分子族成員之一。

Slit蛋白是作為Roundabout(Robo)的配體發揮多功能的導向分子，它不僅具有調節神經軸突生長方向、引導神經細胞遷移、影響神經細胞形態分化的功能。近年來的研究發現，Slit在血管生成、心臟形態發生、腫瘤細胞遷移等多種生理過程中也發揮作用。

在脊椎動物中存在3種Slit基因，即Slitl、Slit2、Slit3，并在各種生物組織中廣泛表達。

Slit蛋白的主要結構包括N端的胞外分泌信號肽,4個連續的富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich?repeat，LRRs),也被命名為D1-D4結構域，串聯的6-9個EGF(epidermal?growth?factor)樣功能區，一個laminin?G樣結構域和一個富含半光氨酸的C末端結構域。

Slit2能夠抑制神經膠質瘤、纖維肉瘤、乳腺癌、口腔鱗癌細胞的遷移，Slit3能夠抑制惡性黑色素瘤細胞的遷移，也有報道稱Slit2能夠促進乳腺癌和結直腸癌細胞的轉移。目前，Slit2對血管生成的作用仍存在爭議，關于Slit2促進血管生成和抑制血管生成的兩方面作用都有文獻報道。Dunaway等發現，在Slit2單獨存在時，體外和體內實驗都證明其能促進血管生成；然而在Ephrin-A1存在時，Slit2則能抑制血管生成，說明體外相對簡單的細胞實驗環境得到的結果并不能完全反映體內的真實作用。

Anil?Prasad等人的研究表明，過度表達Slit2可以抑制乳腺癌細胞以及小鼠體內腫瘤的生長；Tseng等人的研究表明Slit2可以減緩肺癌的發展過程；Yuasa-Kawada等人報道了Slit蛋白能夠抑制乳腺癌細胞的遷移；Werbowetski-Ogilvie等人報道了Slit2能抑制成神經管細胞瘤細胞的侵襲；Yiin等人報道了Slit2能抑制大腦中神經膠質細胞瘤細胞的侵襲。綜合考慮Slit2和/或Robo1基因在腫瘤中存在廣泛的啟動子甲基化而導致功能的缺失，以及Slit2對腫瘤發生發展的抑制作用。

為了研究和應用，有必要對Slit蛋白或其片段進行表達和分離純化。然而，由于天然蛋白的含量有限，分離困難，因此需要開發高效的重組生產工藝。

在重組生產工藝中，高效地生產出構象正確且便于分離和純化的目的蛋白，常常是較為困難的。常用的大腸桿菌表達系統雖然可以較高效地表達目的蛋白，但卻常常需要復雜的復性工藝，且復性后的目標蛋白的活性往往難以令人滿意。

當采用真核表達系統進行表達時，雖然避免了復性工藝，但目標蛋白的正確折疊、如何實現高表達水平以及如何有效分離目標蛋白仍然是難點，尤其是對于某些短肽或含重復序列的多肽而言。

獲得了含目標蛋白的培養液(或發酵產物)后，可采用各種不同的純化手段進行分離純化。目前，一種常用的分離純化重組蛋白的方法為親和層析技術。

以采用的His標簽為例，6×His是專門設計用于重組蛋白質純化工作的標簽蛋白，是目前最常見的表達方式，其表達純化技術都很成熟，而且相對比便宜，它的優點是表達方便而且基本不影響蛋白的活性。通常帶組氨酸蛋白都可以在天然情況下被鎳瓊脂糖凝膠或鎳NTA瓊脂糖凝膠吸附，但是因為His標簽非常小，如果在融合蛋白折疊過程中被折疊到蛋白內部而導致His標簽不容易暴露的話，則很難開展蛋白純化工作；同時His標簽確實還存在特異性不夠的問題。

通常，使用His標簽技術分離所得的蛋白質純度約為90%左右，而現有技術中，使蛋白進一步純化的工藝和步驟都相對較為繁瑣，且添加的蛋白或肽段常會對目標蛋白的活性造成干擾，導致目標蛋白的表達不準確或雜質過多。

綜上所述，為了簡便高效地制備高純度、高活性的重組蛋白，本領域迫切需要開發高效簡便的生產工藝。

發明內容

本發明的目的就是提供一種高效簡便的生產外源蛋白的方法，從而簡便高效地制備高純度、高活性的重組蛋白。

本發明提供了一種融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有式Ia或Ib所述的結構：

A—X—E—Y1—Y2??式Ia；