[發明專利]大腸桿菌O157:H7核酸適體及其應用方法

無效

• 申請號: 201310149068.1
• 申請日: 2013-04-25
• 公開（公告）號: CN103215272A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 吳青;張艷艷
• 申請（專利權）人: 廣州弗賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/68;C12Q1/04;C12N1/20;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

技術領域

本發明涉及一種核酸適體，特別涉及大腸桿菌O157:H7核酸適體及其應用方法。

背景技術

據世界衛生組織最新報道，全球每年發生腹瀉的病歷數高達15億，由此造成了百萬兒童死亡，其中70％的病例歸咎于各種污染食品的微生物。大腸桿菌是最常見的食源性病原微生物，而其中的O157:H7型是一種強致病性的病原菌，該種病原菌常見于牛等溫血動物的腸內，可通過水和未加工熟的食物感染人。該型的大腸桿菌會釋放一種強烈的毒素，引起患者出現嚴重的水瀉、帶血腹瀉、發燒、腹絞痛及嘔吐，情況嚴重時，更可能并發急性腎病甚至敗血癥。5歲以下的兒童出現該等并發癥的風險較高。

目前該類病原菌的檢測方法主要有分離培養法、酶聯免疫法和核酸檢測法。以上方法要么檢測周期久，要么操作復雜、檢測成本高、檢陽性假陰性率高，以上方法都面臨一個病原菌快速分離富集的問題，現階段多采用過濾或梯度離心法，操作復雜效果差，嚴重制約了檢測產品的普及。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種大腸桿菌O157:H7核酸適體。

本發明所述的大腸桿菌O157:H7核酸適體，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

SEQ?ID?NO：1：

TTTACTATCCCCCCATATTTCCAAATTCCCGCCCTTTGGAAATATGAAAATAG。

本發明的核酶適體既包括原始的核苷酸序列，也包括對該原始核苷酸進行修飾/改性得到的序列，修飾/改性的方法包括但不限于對核苷酸本身的化學修飾，化學修飾包括但不限于氨基、巰基、羧基或同位素等修飾；或在核苷酸序列的末端偶聯生物素、連接核苷酸序列、酶、發光基團等。

該核酸序列是通過SELEX技術（指數富集的配基系統進化技術）篩選特異高效結合大腸桿菌O157:H7的核酸序列而得到的，該序列可用于樣本中大腸桿菌O157:H7的富集及檢測。

本發明的第二個目的是提供一種大腸桿菌O157:H7檢測試劑。

本發明所述的大腸桿菌O157:H7檢測試劑，含有本發明所述的序列為SEQ?ID?NO：1的核酸適體。

本發明的第二個目的是提供一種用于大腸桿菌O157:H7的分離富集方法。

本發明所述的用于大腸桿菌O157:H7的分離富集方法，是采用本發明所述的核酸適體用于大腸桿菌O157:H7的分離富集方法，包括以下步驟：

（1）將本發明所述的核酸適體的5’端偶聯在可分離載體上，得到分離富集載體；

（2）將樣本與分離富集載體充分混合，富集得到大腸桿菌O157:H7和復合載體與所述的核酸適體的復合體；

（3）將復合載體上的大腸桿菌洗脫，得到從所述樣品中分離的大腸桿菌O157:H7。

根據本發明所述的分離富集方法的進一步特征，所述的如SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列是通過連接序列偶聯在可分離載體上。

根據本發明所述的分離富集方法的進一步特征，所述步驟（1）中，所述的可分離載體為磁珠，將氨基化修飾的核酸適體與羧基磁珠在EDC催化下進行偶聯。

根據本發明所述的分離富集方法的進一步特征，所述步驟（1）中，所述的可分離載體為微球，將氨基化修飾的核酸適體與羧基微球在EDC催化下進行偶聯。。

根據本發明所述的分離富集方法的進一步特征，連接序列為3～12個核苷酸序列。此核苷酸序列為不影響核酸適體二級結構的隨意序列。該連接序列可避免核酸適體直接偶聯在載體上而導致核酶序列與目標序列因為存在空間位阻而不能很好的結合。優選地，可以在核酶適體的5’端連接若干個核苷酸作為連接序列。

本發明所述的大腸桿菌O157:H7核酸適體，特異性好，親和力高，穩定性好、生產成本低、使用方便。該適體對樣本中的大腸桿菌O157:H7回收效率達到98%，與其它非特異結合的菌體交叉小于2%；使用成本不到抗體的百分之一，且可反復變性復性穩定性好。

利用本發明所述的檢測試劑，可以快速、有效、方便地檢測出大腸桿菌O157:H7。因此，本發明也提供一種可以快速、有效、方便地分離出大腸桿菌O157:H7的分離富集方法。

附圖說明

圖1是大腸桿菌O157:H7核酸適體偶聯磁珠及對靶標菌體富集的一個實施例的示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖進一步說明本發明。