[發明專利]一種酪氨酰tRNA 合成酶突變體的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201310146057.8
• 申請日: 2013-04-25
• 公開（公告）號: CN103409378A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 莫煒;于敏;詹領;郎永江;張艷玲;包志宏
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C07K1/18;A61K38/53;A61P7/04
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種酪氨酰tRNA?合成酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟包括：

（1）工程菌高密度發酵

工程菌復蘇及搖瓶接種：取出原始祖種子菌，100?級潔凈度條件下，在?LBK?平板上接種，37℃?培養?2-3?天；從平板上挑取單菌落，100?級潔凈度條件下接種于?20ml?含?50?μg/ml?kanamycin?LB培養液中，30℃?振搖培養?8?小時，至?OD₆₀₀?為?2，制得一級種子液；將上述一級種子液加入?300?ml?LBK?培液中，30℃?振搖培養?6?小時，至?OD₆₀₀?為?2，制得二級種子液；

（2）發酵罐及?Sl?培養基高壓滅菌

清洗發酵罐，安裝好各個管道，按校正程序進行?pH?校正，加入?3.2?L?S1?培養基，121℃?1.5kg/cm²?高壓滅菌?20?min，冷卻至室溫；

溶氧DO?電極校正和設定各種參數，發酵罐溫度設定為?30℃；無菌條件下，向發酵罐中加入?S2、S3、S4?和?S5培養基；通入純氧，攪拌速度設定為?500?rpm，待?DO?穩定后，按?DO?校正程序將此時?DO?值設定為?100%；

（3）二級種子液接種培養及?IPTG?誘導酪氨酰?tRNA?合成酶突變體表達

在無菌條件下，將所述二級種子液接種入發酵罐內，通入空氣，進行擴增培養；

每隔?1?h?取樣?5ml，測定?OD₆₀₀;控制?DO?50%±10%，觀察?pH、溫度、攪拌轉速；pH?以氨水調節，隨時流加適量消泡劑；至?OD₆₀₀?30，加入?IPTG?誘導?6?小時，停止發酵，4000?rpm?×?20?min?離心，收集菌體；

工程菌在發酵罐內生長至?OD₆₀₀?30，加入?IPTG?，終濃度為?0.5?Mol/L，誘導目的蛋白表達，誘導?6?小時后，表達量占全菌總蛋白的?50%，每升培液收獲濕菌?100g；

（4）純化酪氨酰?tRNA?合成酶突變體

①高壓破菌

菌體用醋酸緩沖液以?1:10?w/v?重懸，將混懸液倒入均質機，300?bar?壓力下，完成均質，1000?bar?壓力下，完成破菌；10,000?rpm?×?30?min?離心，分離上清；

②陽離子交換層析，潔凈度?10000?級，4℃

層析柱規格為?12.5?cm?×?40?cm，填料為?SP-Sepharose?Fast?Flow，純化使用?AKTA?Explore?系統完成，用NaAc-HAc平衡，將上述分離得到的上清上樣，流速?15ml/min；用?NaAc-HAc?沖洗至?OD₂₈₀?達到基線，流速?15ml/min，用?NaAc-HAc-NaCl線性梯度洗脫，流速?15ml/min，監測?OD₂₈₀，收集活性組份；

③凝膠過濾層析，潔凈度?10000?級，4℃

層析柱規格為?12.5?cm?×?100?cm，填料為?SephadexG-50，純化使用?AKTA?Explore?系統完成，用?0.02Mol/L?PB?平衡，將經過陽離子交換層析收集的樣品自動進樣，用?0.02?Mol/L?PB?洗脫，流速?10ml/min，監測?OD280，收集活性組份；

④陰離子交換層析，潔凈度?10000?級，4℃

層析柱規格為2.6?cm?×?10?cm，填料為?Q-sepharose?Fast?Flow，純化使用AKTA?Explore?系統完成，用?0.02?Mol/L?PB?平衡，經凝膠過濾層析收集的組份上樣，流速?15?ml/min，收集上樣峰組分；

一次發酵，純化工藝如下表所示：1?次?5L?規模的發酵，收集菌體?100g，經?3?步純化，獲得純度?＞?95%?的?酪氨酰?tRNA?合成酶突變體?蛋白?350?mg；

?體積 (L)蛋白濃度(mg/ml)蛋白總量 (mg)回收率 (%)發酵收集菌體100 g (重懸1 L)1.0 mg/ml1000 mg0陽離子交換層析0.2 L2.0 mg/ml400 mg40%凝膠過濾層析0.3 L1.33 mg/ml400 mg40%陰離子交換層析0.15 L2.33 mg/ml350 mg35%

。