[發明專利]一種發酵法制取埃博霉素B的方法

有效

• 申請號: 201310143836.2
• 申請日: 2013-04-24
• 公開（公告）號: CN103276028B
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發明（設計）人: 王福清;王福華;殷紅
• 申請（專利權）人: 中科醫藥行業生產力促進中心有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N15/01;C12N13/00;C12N11/10;C12N11/04;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明涉及埃博霉素B高產菌株的誘變選育及利用該菌株發酵制備埃博霉素B的方法，涉及微生物領域。

背景技術

埃博霉素B，英文名epothilone B，纖維堆囊菌Sorangium cellulosum 90的次級代謝產物，分子式為C₂₇H₄₁NO₆S，是一種大環內酯類的化合物。與之相似的次級代謝物還有epothilone A、epothione C、epothilone D、epothilone G、epothiloneH等。Epothilone B的相對分子量為506.25，熔點為93℃-94℃。

埃博霉素B有顯著的選擇性抗乳腺腫瘤細胞和結腸腫瘤細胞的活性，是一種微管超穩定的新型抗腫瘤活性物質。它可以通過穩定已經聚化的微管從而遏制細胞的有絲分裂。在20世紀90年代廣泛應用于臨床的是紫杉醇。但是臨床試驗表明，它對不同的實體瘤細胞有明顯的抗腫瘤活性，且副作用多而受限制。如引發嗜中性白細胞減少癥，外周神經病和脫毛癥等；并且紫杉醇的低水溶性使得它必需由乳化方式給定，它本身可能影響心臟功能，導致過敏反應；此外，是P-糖蛋白的底物。P-糖蛋白可將許多細胞毒物質從細胞泵出，是腫瘤細胞產生多藥物質抗性的原因。然而，紫杉醇的復雜的結構阻礙了通過化學修飾改善可溶性和降低毒性副作用的努力，所以引起了人們對相近作用模式但卻具有好的特性化合物的研究。埃博霉素其離體抑制的效果比藥物紫杉醇強2000-5000倍，作用的有效濃度為10～20ng/mL。在埃博霉素的類似物中，帶甲基的埃博霉素B要比A基本上大2倍。比起紫杉醇來，埃博霉素B是一種更不易受P-糖蛋白作用的物質。因而埃博霉素B的抗腫瘤性能要比紫杉醇強的多，且其抗腫瘤譜要廣的多。另外，紫杉醇可以從太平洋的紫杉的樹皮中提取，但這種樹生長極慢，所以來 源困難。但是對于埃博霉素B來說，可以通過纖維堆囊菌發酵，無限制的獲得，可以解決抗癌藥物的不足，且價格便宜。所以，此抗癌藥物可能成為紫杉醇更新換代的新產品，所以開發比它更優越的埃博霉素來說是非常必要的。

然而，有關纖維堆囊菌的發酵條件及活性物質合成條件的研究報道很少，這一方面反映了纖維堆囊菌研究的困難；另一方面也是全球研究粘細菌生物活性物質合成的實驗室太少的緣故。研究粘細菌，尤其是纖維堆囊菌的生長和次級代謝的條件對于開發粘細菌資源具有重要的意義。

纖維素堆囊菌的培養生產埃博霉素，為了進行埃博霉素的大規模生產，生物發酵是理想的途徑。粘細菌纖維素堆囊菌的兩種發酵產物埃博霉素A和B，已有專利報道了大規模發酵生產埃博霉素A和B。GerthK研究組利用纖維素堆囊菌Soce90進行350L(裝液230L)發酵生產埃博霉素A和B，以XAD-16樹脂作為吸附劑，分別得到埃博霉素A和B為11和22mg/L。但是在工業化生產中加入樹脂帶來管子堵住、設備磨損、滅菌不徹底很多不便，已有專利報道在發酵液中以環糊精代替樹脂作為吸附劑來解決這一系列問題。又如李越中等以VY/2培養基作為纖維堆囊菌Soce90菌株的培養基，接種于ME培養液中，發酵培養4天左右，經分離提純便得到埃博霉素B。

埃博霉素的發酵合成近年來研究的比較少，除外國的Gerthk以外，我國山東大學的微生物技術國家重點實驗室也在研究。其中，吳斌輝等以纖維堆囊菌Soce9733-1作為研究對象，液體搖瓶發酵用Ck6培養基。結果表明纖維堆囊菌對可溶性淀粉、木聚糖、纖維素等復雜碳源的利用能力較強，簡單碳源中只利用葡萄糖；KNO₃、蛋白胨是較好的氮源，大多數氮源都能支持生長，表明該菌營養要求簡單，能高效的利用自然界里豐富的纖維素資源。堆囊菌的鹽耐受能力較低，鹽濃度高于1％的培養基中菌體幾乎不能生長，Mg²⁺是生長必需的元素， Ca²⁺對生長沒有明顯的作用，但是子實體的形態發生所必需的。培養基的起始pH為7.0時細胞生長較好，大于8.0或小于5.0不生長。李越中等以Soce90作為研究對象，以VY/2培養基作為纖維堆囊菌Soce90菌株的培養基，接種于ME培養液中，發酵培養4天左右，結果表明菌體的生長狀態對產物的合成有影響，指數期接種物、低氮高碳培養條件、某些鹽離子、氨基酸和乙酸鹽對epothilones的合成有益，以此獲得較為穩定epothilons產量的條件因素。