[發明專利]一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用

有效

• 申請號: 201310142896.2
• 申請日: 2013-04-23
• 公開（公告）號: CN103224921A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 王明鈺;趙秋爽;方詡;侯少麗
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N1/15;C12R1/885
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用，特別涉及一種在固態發酵培養下真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

固態發酵是微生物在沒有或基本沒有游離水的固態基質上的發酵方式，固態基質中氣、液、固三相并存，即多孔性的固態基質中含有水和水不溶性物質。與其他培養方式相比，固態發酵具有很多優點，因此，固態培養已經成為一種普適性的培養方法，在白酒、陳醋和產酶的生產工藝上應用較為成熟。

真菌分泌的纖維素酶主要有外切葡聚糖苷酶，內切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，其中外切酶占大多數。自然界中植物光合作用產物的絕大部分是作為植物細胞壁組分的木質纖維素類物質，大約占生物質資源總量的80%以上，此外，每年農林廢棄物和工業纖維性廢渣也有上億噸，而木質纖維素中纖維素主要以結晶狀態存在,外切葡聚糖酶是唯一對結晶纖維素起作用的纖維素酶,在木質纖維素降解成還原糖的過程中,外切葡聚糖酶起著非常關鍵的作用。因此要更加充分利用自然界中廣泛存在的纖維素資源，外切葡聚糖酶是不可缺少的。β-葡萄糖苷酶在其它方面也有重要作用，比如芳香植物中有許多以糖苷鍵合態形式存在的風味前體物質，通過β-葡萄糖苷酶的水解可以釋放出其中潛在的芳香成分,從而可以增加植物芳香物，這對于天然香精香料工業有著重要意義(陳軍杰（2005）。β-葡萄糖苷酶的液態發酵生產及其應用。江南大學)。在纖維素降解上，真菌分泌的纖維素酶液中β-葡萄糖苷酶酶活較低，通常導致纖維二糖的積累，致使其反饋抑制纖維二糖水解酶和內切酶的酶活，因此，若酶液中β-葡萄糖苷酶酶活提高，會降解纖維二糖解除這種抑制作用，從而促進纖維素的降解。（張裕卿，梁江華，李濱縣（2007），β-葡萄糖苷酶促進纖維素降解的應用，天津大學學報第40卷第3期317-320）。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，在固態條件下提供一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用。

本發明技術方案如下：

一種核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的真菌纖維素酶酶活調控基因在制備高活性真菌纖維素酶系中的應用。

上述應用，將里氏木霉中的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的基因片段敲除后，插入尿苷篩選標記，然后經固態發酵后，制得高活性真菌纖維素酶系。

上述應用，具體步驟如下：

將核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示基因片段轉化入里氏木霉（Trichodermareesei）中，轉化的同時敲除了里氏木霉中核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的基因片段，制得轉基因里氏木霉，然后在固體培養基中，28～32℃培養4～6天，用pH4.8、濃度為0.05mol/L檸檬酸緩沖液浸泡菌體2～3h，經離心分離，取上清，制得高活性真菌纖維素酶系。

根據本發明優選的，所述固體培養基組分如下，每十五克組分如下：

麩皮2g，（NH₄）SO₄0.5g，KH₂PO₄1.5g，MgSO₄0.06g，CaCl₂0.06g，微晶纖維素2g，余量水。

根據本發明優選的，所述里氏木霉（Trichodermareesei）為里氏木霉（Trichodermareesei）QM9414△Ku70菌株，菌種保藏編號：26921，購自美國菌種保藏中心（ATCC）。

根據本發明優選的，所述的離心，條件為12000rpm離心10min。

有益效果

本發明所述的真菌纖維素酶酶活調控基因可用于調控真菌中纖維素酶酶系，通過敲除盒取代該真菌纖維素酶酶活調控基因后，相比原初發菌株，在固態條件下培養，外切葡聚糖甘酶酶活和β-葡聚糖甘酶比酶活分別提高2.5倍和3倍，相較現有采用復配提高酶活的方法，更加方便，從而可以滿足各行業對不同纖維素酶酶活的需求。

附圖說明

圖1是實施例1制得的敲除盒的電泳圖。

其中：1、實施例1中里氏木霉（Trichodermareesei）QM9414△Ku70當中構建的敲除盒，2、2kb?PlusⅡMarker；

圖2是實施例3得到的轉化子驗證示意圖。

圖3是實施例3得到的轉化子PCR驗證圖。