[發(fā)明專利]一種適合于雙向電泳的大小鼠睪丸組織樣品全蛋白提取和分離的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310142430.2
• 申請日: 2013-04-23
• 公開（公告）號: CN103278370A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建海;羅廣營;牛瑞燕;王金明;孫子龍;王俊東
• 申請（專利權(quán)）人: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34
• 代理公司: 太原晉科知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 鄭晉周

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的提取和蛋白組學(xué)分離方法，具體涉及一種適合于雙向電泳的大小鼠睪丸組織樣品全蛋白提取和分離的方法。?

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體生命活動的主要大分子。隨著人和動物等大量生物全基因組序列的破譯和功能基因組研究的展開，生命科學(xué)家越來越關(guān)注如何用基因組研究的模式開展蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)將成為新世紀最大戰(zhàn)略資源－人類基因爭奪戰(zhàn)的戰(zhàn)略制高點之一。目前，國際上蛋白質(zhì)組研究進展十分迅速，不論基礎(chǔ)理論還是技術(shù)方法，都在不斷進步和完善。由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究比基因組學(xué)研究更接近實用，有著巨大的市場前景，已成為西方各主要發(fā)達國家、各跨國制藥集團競相投入的“熱點”。然而，整體上蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展既是技術(shù)所推動的也是受技術(shù)限制的。蛋白質(zhì)組學(xué)研究成功與否，很大程度上取決于其技術(shù)方法水平的高低。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準確性的研究技術(shù)平臺是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究及相關(guān)領(lǐng)域的主要任務(wù)。?

雙向凝膠電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一種核心關(guān)鍵技術(shù)之一。其基本原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，最終把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。同時結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對分離的蛋白質(zhì)逐一進行鑒定。因其在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，被廣泛用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究，蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用，毒理蛋白組學(xué)、細胞分化凋亡研究，致病機制及耐藥機制的研究，療效監(jiān)測，新藥開發(fā)，癌癥研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，生殖發(fā)育生物學(xué)等許多方面。然而，雙向凝膠電泳技術(shù)本身存在的步驟繁瑣、不穩(wěn)定和低靈敏度等一系列缺點大大限制了其應(yīng)用。更為重要的是，雙向電泳技術(shù)的有效性、可靠性以及可重復(fù)性都依賴于所分析蛋白樣品的制備。對于大多數(shù)動物組織而言，雙向電泳蛋白樣品的制備及整個技術(shù)體系，沒有統(tǒng)一的方法和程序。絕大多數(shù)的樣品都需要通過多次試驗摸索最適宜的條件，費時費力，實驗成本較高。?

實驗大小鼠是最常采用模式動物，睪丸組織是生殖發(fā)育和雄性生殖毒理研究中涉及蛋白組學(xué)研究必不可少的材料。因此，如何針對大小鼠睪丸組織，建立一套有效的、可重復(fù)的樣品制備方法及雙向電泳技術(shù)體系，對整個雙向電泳技術(shù)的大規(guī)模推廣應(yīng)用具有重要意義。本發(fā)明在多次分別嘗試了國內(nèi)外目前普遍采用的勻漿液提取法、裂解液提取法、裂解液提取/丙酮沉淀法等大小鼠睪丸蛋白提取基礎(chǔ)上，提出了改良的裂解液提取/丙酮沉淀法，修改了裂解液配方，并優(yōu)化了整個雙向電泳技術(shù)體系，建立了適合大小鼠睪丸雙向電泳樣品制備和分離的方法,得到了分辨率較高和重復(fù)性較好的電泳圖譜。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種適合于雙向電泳的大小鼠睪丸組織樣品全蛋白提取和分離的方法，其步驟如下：?

（1）將實驗大小鼠放入盛有乙醚的箱內(nèi)，待其窒息后，固定于解剖盤，切開陰囊，剝離其周圍組織，摘除睪丸，并用超純水沖洗，然后去除被膜，稱重；

（2）將（1）處理的睪丸組織與預(yù)冷的組織樣品蛋白裂解液以質(zhì)量體積比為1:5的比例混合后，電動組織勻漿儀11,000?rpm勻漿，每次10s,間隔1min,連續(xù)3-5次，直至體系呈均質(zhì)狀懸濁液，整個過程樣品管始終置于冰浴中；

（3）將（2）處理后的懸濁液在室溫下靜置1h，使蛋白充分溶解，然后在4℃、16000g離心1?h，然后吸取上清液，用Bradford法測定得上清液的蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果將上清液按體積分裝3-4份，使每份上清液的蛋白含量保持至400-500ug；?

（4）將（3）所得上清液與5倍體積的80%預(yù)冷丙酮混勻，-18―-20℃放置15min－60min；

（5）將（4）處理液在4℃、16,000g離心5min，棄去上清，置于超凈工作臺中正置,?微風(fēng)吹拂10s-30s，得待溶解的沉淀蛋白樣品；

（6）取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液1ml置1.5ml?EP管中，室溫溶解后，加入0.01g?DTT,?2.5mL?Bio-Lyte?4-6，2.5mL?Bio-Lyte?5-7，充分混勻，取出400ml，加入（6）得沉淀蛋白樣品中，充分溶解，混勻；

（7）用移液搶將（6）得到的蛋白樣品從左至右沿著邊緣線性加入到聚焦盤中，保持槽中間的樣品液連貫，槽兩端各留1－1.2cm距離，同時，在聚焦盤電極的兩側(cè)分別放置鹽橋，并用10uL的超純水浸濕，然后將水化好的膠條轉(zhuǎn)入聚焦盤中，膠面朝下，正負極對應(yīng)，沿著每根膠條上緩慢的加入2-3mL礦物油，與聚焦槽的正負極對好，蓋上蓋子；