[發(fā)明專利]一種用膜透性法驗(yàn)證蕨類植物配子體化感作用的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310141380.6
• 申請(qǐng)日: 2013-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103197052A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張開(kāi)梅;沈羽;方炎明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/50
• 分類號(hào): G01N33/50;G01N15/08
• 代理公司: 南京君陶專利商標(biāo)代理有限公司 32215
• 代理人: 沈根水

1.一種用膜透性法驗(yàn)證蕨類植物配子體化感作用的方法，其特征是該方法包括如下步驟：

一、蕨類配子體膜透性數(shù)據(jù)收集與分析；

二、化感作用對(duì)植物膜透性變化的驗(yàn)證。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用膜透性法驗(yàn)證蕨類植物配子體化感作用的方法，其特征是所述的步驟一、蕨類配子體膜透性數(shù)據(jù)收集與分析；具體包括，

1、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：

DDS-307雷磁直讀電導(dǎo)率儀；一次性塑料培養(yǎng)皿15皿；預(yù)培養(yǎng)20天的井欄邊草配子體；

2、實(shí)驗(yàn)處理設(shè)計(jì)：

1）取預(yù)培養(yǎng)20天的井欄邊草配子體，放入10mL質(zhì)量濃度為0.1g/mL的三葉鬼針草葉的水提液，并設(shè)置體積濃度梯度分別為100%、50%、25%、12.5%以及空白組，轉(zhuǎn)移入一次性塑料培養(yǎng)皿中，每皿約100枚配子體，每組體積濃度梯度有三個(gè)平行組；實(shí)驗(yàn)時(shí)間為10天，在第2、4、6、8、10天進(jìn)行井欄邊草配子體的膜透性的測(cè)定；

2）校準(zhǔn)DDS-307雷磁直讀電導(dǎo)率儀：將電極放入注入30mL的去離子水的50mL高懸杯中，把DDS-307雷磁直讀電導(dǎo)率儀“選擇”開(kāi)關(guān)指向“檢查”，“常數(shù)”補(bǔ)償旋鈕指向“1”刻度線，“溫度”補(bǔ)償旋鈕指向“25”度線，調(diào)節(jié)“校準(zhǔn)”調(diào)節(jié)旋鈕，使儀器顯示“100.0μS/cm”，至此校準(zhǔn)完畢；每次實(shí)驗(yàn)前均需校準(zhǔn)DDS-307雷磁直讀電導(dǎo)率儀；

3）配子體處理：每組每次選取6枚長(zhǎng)勢(shì)相近的配子體，用直徑3mm的鋼針在選取的配子體葉片上穿孔，一枚配子體進(jìn)行兩次穿孔；

4）膜電導(dǎo)率的測(cè)定：取50mL高懸杯，注入30mL的去離子水，將每組進(jìn)行過(guò)穿孔的配子體放入杯中，1分鐘后，用DDS-307雷磁直讀電導(dǎo)率儀在1檔進(jìn)行讀數(shù)，記錄此時(shí)數(shù)值，記為處理電導(dǎo)率值；隨后，將盛有配子體的高懸杯，通過(guò)恒溫電熱板加熱煮沸，冷卻后，用去離子水補(bǔ)充至30mL體積，用DDS-307雷磁直讀電導(dǎo)率儀在1檔進(jìn)行讀數(shù)，記錄此時(shí)數(shù)值，記為煮沸電導(dǎo)率值；

5）實(shí)驗(yàn)公式：

電解質(zhì)的相對(duì)外滲率（％）=（處理電導(dǎo)率值-空白電導(dǎo)率值）/（煮沸電導(dǎo)率值-空白電導(dǎo)率值）

膜傷害度（%）=（處理組電解質(zhì)的相對(duì)外滲率-空白組電解質(zhì)的相對(duì)外滲率）/（1-空白組電解質(zhì)的相對(duì)外滲率）

3、數(shù)據(jù)分析：

電解質(zhì)的相對(duì)外滲率（％）：在不同濃度梯度的三葉鬼針草葉的水提液的處理下，配子體的電解質(zhì)的相對(duì)外滲率（％），基本呈現(xiàn)空白組<12.5%<25%<50%<100%，即隨著三葉鬼針草葉的水提液濃度升高電解質(zhì)的相對(duì)外滲率（％）呈上升的趨勢(shì)，得證隨著三葉鬼針草葉的水提液濃度的升高，三葉鬼針草葉的水提液對(duì)配子體的化感作用呈加強(qiáng)趨勢(shì)；

膜傷害度（%）：在不同濃度梯度的三葉鬼針草葉的水提液的處理下，配子體的膜傷害度（%），基本呈現(xiàn)空白組<12.5%<25%<50%<100%，即隨著三葉鬼針草葉的水提液濃度升高膜傷害度（％）呈上升的趨勢(shì)，得證隨著三葉鬼針草葉的水提液濃度的升高，三葉鬼針草葉的水提液對(duì)配子體的化感作用呈加強(qiáng)趨勢(shì)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用膜透性法驗(yàn)證蕨類植物配子體化感作用的方法，其特征是所述的步驟二、化感作用對(duì)植物膜透性變化的驗(yàn)證，具體包括：

1、實(shí)驗(yàn)步驟：

1）取100%、50%、25%、12.5%以及空白組的三葉鬼針草葉的水提液的配子體0.100g，

2）酶粗提取液的制備：用5mL的pH=7.5的磷酸緩沖液冰浴研磨，5000轉(zhuǎn)/分離心，10分鐘后取出待用；

3）丙二醛含量測(cè)定：

將體系為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的2-硫代巴比妥酸3.5mL和1.5mL酶粗提取液渦旋混勻；在100℃水浴鍋上煮沸20分鐘；放入冰浴中迅速冷卻；在轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分條件下離心15分鐘；取離心后體系的上清液在可見(jiàn)光分光光度儀SP-2100上，分別在450nm、532nm和600nm處測(cè)定其吸光度OD值；計(jì)算公式：

丙二醛（u?g^-1F?W）=[6.452×(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.559×OD₄₅₀]×Vt÷（Vs×W）（式中：Vt：提取液總體積（mL）；Vs：測(cè)定用提取液體積（ml）；W：樣品鮮重（g））；

4）TBARs含量的測(cè)定：

將體系為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氯乙酸2.5mL和1mL酶粗提取液渦旋混勻；在轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分條件下離心20分鐘；取出上清液，加入1.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的2-硫代巴比妥酸2.4mL；在95℃水浴條件下30分鐘；在轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘；取離心后體系的上清液在可見(jiàn)光分光光度儀SP-2100分別在532nm和600nm處測(cè)定其吸光度OD值；計(jì)算公式：

TBARs（nmol?g^-1F?W）=（OD₅₃₂-OD₆₀₀）×Vt×Vs÷（155×W×A）（式中：Vt：提取液總體積（mL）；Vs：測(cè)定用提取液體積（ml）；W：樣品鮮重（g）；A：體系酶提取液體積（mL））；

2、數(shù)據(jù)分析：

1）丙二醛含量分析：在不同濃度梯度的三葉鬼針草葉的水提液的處理下，配子體的丙二醛含量，基本呈現(xiàn)空白組<12.5%<25%<50%<100%，即隨著三葉鬼針草葉的水提液濃度升高丙二醛含量呈上升的趨勢(shì)，證明隨著三葉鬼針草葉的水提液濃度的升高，三葉鬼針草葉的水提液對(duì)配子體的化感作用呈加強(qiáng)趨勢(shì)；

2）TBARs含量分析：在不同濃度梯度的三葉鬼針草葉的水提液的處理下，配子體的TBARs含量，基本呈現(xiàn)空白組<12.5%<25%<50%<100%，即隨著三葉鬼針草葉的水提液濃度升高TBARs含量呈上升的趨勢(shì)，證明隨著三葉鬼針草葉的水提液濃度的升高，三葉鬼針草葉的水提液對(duì)配子體的化感作用呈加強(qiáng)趨勢(shì)；

通過(guò)丙二醛和TBARs兩個(gè)膜相關(guān)指數(shù)的數(shù)據(jù)分析，證明三葉鬼針草配子體的化感作用通過(guò)膜透性的電導(dǎo)率指標(biāo)來(lái)判定。