[發(fā)明專利]一種利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310139348.4
• 申請日: 2013-04-19
• 公開（公告）號: CN103194487A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 滕小娟;開國銀;季倩;時(shí)敏;崔麗潔
• 申請（專利權(quán)）人: 上海師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/60;C12N15/53;A01H5/06
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

1.一種利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-羥化酶基因CrG10H插入植物表達(dá)載體，構(gòu)建重組載體；

(2)將步驟（1）所獲得的重組載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌；

(3)利用所構(gòu)建的含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化短小蛇根草，獲得毛狀根；

(4)檢測步驟（3）毛狀根中的CrSTR和CrG10H基因，取篩選結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克??；

(5)利用植物激素對獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根進(jìn)行誘導(dǎo)，使其喜樹堿含量進(jìn)一步提高。

2.權(quán)利要求1所述利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，步驟（1）中的CrSTR和CrG10H基因片段以長春花幼苗RNA為模板PCR獲得。

3.權(quán)利要求1所述利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，步驟（1）中的植物表達(dá)載體為pCAMBIA質(zhì)?；騪BI質(zhì)粒。

4.權(quán)利要求1所述利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，步驟（2）所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4或發(fā)根農(nóng)桿菌菌株L?BA9402。

5.權(quán)利要求1所述利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，步驟（3）中用含有重組植物表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株遺傳轉(zhuǎn)化短小蛇根草莖段，獲得毛狀根。

6.權(quán)利要求1所述利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，步驟（4）所述的檢測方法為PCR及Southern?blotting檢測。

7.權(quán)利要求1所述利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，步驟（5）所述的植物激素為茉莉酸、脫落酸、水楊酸或二甲基亞砜。

8.權(quán)利要求1所述利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，步驟（5）中，將所獲得的毛狀根液體培養(yǎng)35～45天后用植物激素誘導(dǎo)。

9.權(quán)利要求1所述利用基因共轉(zhuǎn)化策略獲取喜樹堿新型藥源的方法，其特征在于，將步驟（5）獲得的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因毛狀根粗提物進(jìn)行抗腫瘤活性分析；所述抗腫瘤活性分析方法為MTT法。

10.一種用于提高喜樹堿含量的重組載體，其特征在于，含有異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-羥化酶基因CrG10H。