[發(fā)明專利]乙型肝炎病毒P區(qū)變異及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310139142.1
• 申請日: 2013-04-19
• 公開（公告）號: CN104109720A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 屠紅;趙芝梅;金晏;高付敏;陳陶陽;吳燕;甘愉
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒P區(qū)變異；基于這些變異情況，本發(fā)明提供了可用于肝癌預(yù)測以及早期(輔助性)診斷的檢測試劑或試劑盒。?

背景技術(shù)

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，已占居民腫瘤死亡的第二位。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是導(dǎo)致我國肝癌發(fā)生的首要原因。我國約有HBV表面抗原(HBsAg)攜帶者1.2億，他們中相當(dāng)部分的慢性肝炎患者，經(jīng)10～20年的發(fā)展會進(jìn)入肝硬化狀態(tài)，而肝硬化患者中每十年即有30～50%的人將演變成肝癌。近年來，隨著乙肝疫苗的普遍應(yīng)用，我國兒童中肝炎的發(fā)病得到了很好的控制。但在那些已經(jīng)感染了乙肝病毒的人群中，肝癌的發(fā)病率和死亡率卻仍然呈上升趨勢。?

乙型肝炎病毒屬于嗜肝性DNA病毒科，其基因組為部分環(huán)狀雙鏈DNA，約3200bp，由正鏈和負(fù)鏈構(gòu)成(圖1)。負(fù)鏈含有4個開放讀碼框(Open?Reading?Frame，ORF)：前S/S區(qū)、X區(qū)、P區(qū)(聚合酶)以及P區(qū)(precore/core，pre-C/C)；除此之外還有多個基因表達(dá)調(diào)控序列，包括2個直接重復(fù)序列(DRI、DRII)、2個增強(qiáng)子(ENI、ENII)和4個啟動子(SP1、SP2、XP和CP)。HBV前S/S區(qū)包括前S1基因、前S2基因和S基因，分別編碼病毒包膜大蛋白(400aa)、中蛋白(271aa)和小蛋白(226aa)；X區(qū)編碼HBV?X蛋白；HBV的前C基因及C基因則共享另一個開放讀碼框P區(qū)，根據(jù)不同的起始密碼子，分別編碼病毒核心抗原(Hepatitis?B?Core?Antigen，HBcAg)和e抗原(Hepatitis?B?e?Antigen，HBeAg)，P區(qū)編碼DNA聚合酶。?

P基因是最長的開放讀框，與C、S與X基因重疊，具體的堿基相對位置見圖2。P基因主要編碼HBV聚合酶。HBV聚合酶是乙肝病毒復(fù)制的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)功能的不同，HBV聚合酶從氨基端開始分為四個區(qū)，分別為末端蛋白區(qū)(TP)、間隔區(qū)(SD)、逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT)和RNase?H區(qū)。其中逆轉(zhuǎn)錄酶RT區(qū)是HBVDNA聚合酶的主要功能區(qū)，同時具有反轉(zhuǎn)錄酶及DNA聚合酶活性，作用是將?前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈HBV?DNA，并以此負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA。HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)可進(jìn)一步分為五個主要的功能域，A區(qū)(421～436氨基酸)、B區(qū)(506～528氨基酸)、C區(qū)(546～550氨基酸)、D區(qū)(576～589氨基酸)及E區(qū)(592～600氨基酸)。這五個區(qū)域的氨基酸高度保守，為維持反轉(zhuǎn)錄酶活性所必須，其中A、C、D區(qū)為聚合酶與三磷酸核苷結(jié)合的結(jié)合域，B、E區(qū)為RNA模板和引物定位域。目前臨床應(yīng)用的擬核苷類藥物主要的靶位點(diǎn)位于逆轉(zhuǎn)錄酶RT區(qū)的B及C區(qū)，HBV多聚酶的催化域即位于C區(qū)的YMDD基序。也是拉米夫定等抗病毒藥物治療時HBV最常出現(xiàn)變異的區(qū)域。P基因變異主要見于POL/RT基因片段(349～692aa，即rt1～rt344)。在拉米夫定的抗病毒治療中，最常見的是酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(YMDD)變異，即由YMDD變異為YIDD(rtM204I)或YVDD(rtM204V)，并常伴有rtL180M變異，且受藥物選擇而逐漸成為對拉米夫定耐藥的優(yōu)勢株。較早的研究報道，多為P基因與拉米夫定等核苷酸耐藥有關(guān)系，P基因與肝癌的發(fā)生關(guān)系至今仍很少報道。?

目前常用的基因突變檢測方法包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)，基因芯片及DNA序列測定技術(shù)。PCR-SSCP用于檢測基因突變操作繁瑣、檢測通量低，而且不能判斷特異性位點(diǎn)的突變形式。而RFLP是使用核酸內(nèi)切酶對擴(kuò)增后的靶序列特異性位點(diǎn)的切割，然后通過電泳檢測判斷不同的基因型，但是由于HBV基因組分子進(jìn)化速度較快、變異頻繁，因此結(jié)果分析準(zhǔn)確率較低。近年來，基因芯片技術(shù)已成功應(yīng)用于核酸分析，對檢測HBV基因組多態(tài)性具有很大的優(yōu)勢，但因其檢測費(fèi)用昂貴而限制了該技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室的推廣和應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域有必要開發(fā)優(yōu)化的且切實(shí)可推廣應(yīng)用的臨床檢測技術(shù)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供乙型肝炎病毒P區(qū)變異及其用途。?

本發(fā)明的目的還在于提供用于肝癌預(yù)測以及早期(輔助性)診斷的檢測試劑或試劑盒。?

在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測核酸樣品中是否存在乙型肝炎病毒P區(qū)變異的試劑盒，它包括：?

擴(kuò)增含有乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位堿基序列的引物；和/或?

與乙型肝炎病毒P區(qū)第1055位為堿基“A”的序列結(jié)合的探針。?