[發(fā)明專利]一種用枯草芽孢桿菌工程菌降解植物的木質(zhì)素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310134625.2
• 申請日: 2013-04-03
• 公開（公告）號: CN103321074A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張愛聯(lián);符仙;尹慧祥;楊穗珊;張?zhí)碓?/a>;羅進(jìn)賢;易國輝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所
• 主分類號: D21C5/00
• 分類號: D21C5/00;C12N15/75;C12N15/53;C12N1/21;C12R1/125
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建和應(yīng)用微生物工程菌的方法。具體是應(yīng)用微生物工程菌降解植物原料的木質(zhì)素的方法。?

背景技術(shù)

錳過氧化物酶(Manganese?Peroxidase，MnP)、木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin?Peroxidase，LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木質(zhì)素的作用。?

植物資源不斷再生，十分豐富。植物的基本成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。其中在制造沼氣和乙醇業(yè)中有用的成分是纖維素，次之是半纖維素。前者由葡萄糖構(gòu)成，而后者由戊糖構(gòu)成。這些糖都是轉(zhuǎn)化為乙醇和沼氣的物質(zhì)。但是纖維素分子之間被木質(zhì)素鑲嵌，被鑲嵌著的纖維素不能被水解。木質(zhì)素是廣泛存在于植物體中的無定形的、分子結(jié)構(gòu)中含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物，形成纖維支架，結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。欲利用纖維素則必須先降解木質(zhì)素。當(dāng)前用于降解木質(zhì)素的方法有物理、化學(xué)和生物的方法。物理法主要是機械粉碎法、高溫?zé)峤忸A(yù)處理以及輻射預(yù)處理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊設(shè)備；化學(xué)法主要是酸或堿處理的方法。化學(xué)處理法具有工藝簡單的特點，但是處理后的纖維素和半纖維素?fù)p失大，并且產(chǎn)生大量的酸堿廢氣物污染環(huán)境。與化學(xué)法和物理法相比，當(dāng)前應(yīng)用的生物法主要是應(yīng)用天然的表達(dá)分泌降解木質(zhì)素的酶的白腐真菌與植物原料作用而降解植物原料中的木質(zhì)素。應(yīng)用白腐真菌降解植物的木質(zhì)素的優(yōu)勢在于，白腐真菌具有完整的降解木質(zhì)素的酶系(錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶)，其不足之處是白腐真菌所含的錳過氧化物酶基因、木質(zhì)素過氧化物酶基因和漆酶基因只是單拷貝，表達(dá)的酶的產(chǎn)量少，并且，白腐真菌生長緩慢，降解木質(zhì)素的周期長。?

枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)是常用于生產(chǎn)重組蛋白的微生物。枯草芽孢桿菌營養(yǎng)要求低，生長能力強，能將表達(dá)的蛋白分泌到胞外。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌；用含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、錳過氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌與植物原料作用，通過含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架、錳過氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌分泌錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木質(zhì)素。?

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：?

1.克隆基因：應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR或PCR從含錳過氧化物酶基因、木質(zhì)素過氧化物酶基因、漆酶基因的微生物中分別克隆錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶基因。?

2.通過PCR擴(kuò)增或DNA序列合成而獲得構(gòu)建表達(dá)載體所需的啟動子，重組序列，信號肽，轉(zhuǎn)錄終止子和抗性基因表達(dá)框架的DNA序列。?

3.通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(附圖1)。?

4.將以上構(gòu)建的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。根據(jù)表達(dá)載體上的G418抗性篩?選高拷貝重組子作為含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌。?

5.將以上構(gòu)建含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素。?

本發(fā)明構(gòu)建了含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌，將這種枯草芽孢桿菌工程菌與植物原料作用，降解植物的木質(zhì)素的優(yōu)點體現(xiàn)于：?

由于工程菌的構(gòu)建選擇了強的啟動子調(diào)控基因，選擇生產(chǎn)性能好的微生物作為工程菌構(gòu)建的對象，并且選擇高拷貝的重組子作為工程菌，所以，本發(fā)明構(gòu)建的含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架和含漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌不僅具備枯草芽孢桿菌本身的營養(yǎng)要求低、生長繁殖迅速等特點，還具備工程菌的良好表達(dá)分泌降解木質(zhì)素的酶系(錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶)的功能，這種含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程菌的木質(zhì)素的降解作用強于當(dāng)前應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素的天然的表達(dá)分泌木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的天然的微生物。?

附圖說明

附圖1.枯草芽孢桿菌表達(dá)載體。?