[發明專利]人間充質干細胞培養上清液凍干粉的制備方法

有效

• 申請號: 201310133711.1
• 申請日: 2013-04-17
• 公開（公告）號: CN103251649B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 馮文峰;佘志勇;方海慶;陳建興
• 申請（專利權）人: 馮文峰;佘志勇;陳建興;方海慶
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K38/17;A61K8/64;A61K9/19;A61P17/00;A61Q19/00
• 代理公司: 廣州容大專利代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

1.一種人脂肪間充質干細胞培養上清液凍干粉的制備方法，其特征在于，由以下步驟完成：

(1)干細胞的培養：用含有自體血清的間充質干細胞培養基培養傳代人脂肪間充質干細胞；具體過程為：無菌吸取脂肪抽提液，用PBS沖洗數次，去除吸脂手術中所用藥物及血細胞；用0.1％I型膠原酶37℃消化l小時，400g離心5min，吸棄上層脂肪后，混勻用200目篩網過濾，所獲得的細胞懸液1200r/min，離心8min，細胞沉淀用PBS洗滌后，調細胞濃度為l×109個/L，用所述間充質干細胞培養基懸浮，接種于lOcm培養皿中，置于37℃、體積分數5％C0₂培養箱中培養；48小時后，吸出懸浮細胞液體，更換新培養基，3天換液1次，培養10天左右細胞達80％以上匯合度時，進行傳代培養記為Pl；3-4天左右再傳代，依次記為Pl-Pl0代，所述間充質干細胞培養基為含體積分數10％的自體血清、青霉素lOOU/mL和鏈霉素lOOU/mL的低糖DMEM培養基；

(2)上清液的收集：收集低傳代人脂肪間充質干細胞培養上清液，具體為：培養人脂肪間充質干細胞，當生長到80-90％匯合度時，收集培養上清液，并與等體積的新鮮培養基混合，繼續用于細胞的擴大培養，如此反復至細胞傳代至10代，收集全部細胞培養上清液，用于后續凍干粉的制備；

(3)凍干粉的制備：將所收集的上清液制備成凍干粉，具體包括以下步驟：

①在超凈工作臺中收集低傳代數的人脂肪間充質干細胞培養上清液，離心；

②在超凈工作臺中打開離心管，用無菌槍頭吸出離心管中的上清液至一無菌的收集管中，棄沉淀，記錄標志，-80℃凍存凝固備用；

③將-80℃凍存凝固的上清液抽真空，升華干燥，除去冰晶，最后制得凍干粉，-20℃保存。

2.根據權利要求1所述人脂肪間充質干細胞培養上清液凍干粉的制備方法，其特征在于，所述低傳代間充質干細胞為傳代培數2-10之間。