[發(fā)明專利]鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表達(dá)載體及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310133296.X
• 申請(qǐng)日: 2013-04-17
• 公開（公告）號(hào): CN103215297A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 伊日布斯;過敏;錢龍;趙琳;唐麗薇;嚴(yán)金平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/60;C12N9/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達(dá)鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶蛋白（ZH0-I）的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-ZH0-I及其在制備海藻酸裂解酶ZH0-I蛋白中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來，由于能源危機(jī)的加劇，環(huán)境問題日益突出，以海藻生物質(zhì)為原料生產(chǎn)生物能源越來越受到重視。大型海藻含有豐富碳水化合物，如海藻酸，開發(fā)相應(yīng)的技術(shù)可將其轉(zhuǎn)化為生物乙醇，產(chǎn)量高，且容易預(yù)處理。目前，海藻酸降解的方法可分為三大類：一類是化學(xué)降解法，目前廣泛采用的是酸水解法，這種方法操作步驟繁瑣，反應(yīng)條件劇烈。此外，還有過氧化氫氧化降解法；第二類是物理降解法，例如超聲降解海藻酸；第三類是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸條件溫和，過程可控，得率高，綠色安全，環(huán)境友好，作用機(jī)理明確，產(chǎn)物確定，可以根據(jù)具體目的產(chǎn)物要求選擇單一或組合使用不同底物專一性的酶制劑。

目前，海藻酸裂解酶的生產(chǎn)大多是依靠海藻酸分解菌。雖然野生型海藻酸分解菌能有效的獲得一定量的酶蛋白，但產(chǎn)量很低成本較高，難達(dá)到實(shí)際應(yīng)用要求。因此，利用基因工程手段對(duì)海藻酸裂解酶基因進(jìn)行異源表達(dá)是提高海藻酸裂解酶產(chǎn)量的最有效途徑。1993年，Boyd等首次克隆了Pseudomonas?alginovora海藻酸裂解酶的編碼基因algL并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，其粗蛋白活性達(dá)到146U/mg。1996年Frederic等將Pseudomonas?alginovora中編碼海藻酸裂解酶的基因aly在大腸桿菌中表達(dá)，并且其催化活性達(dá)到97U/mg。2009年，Gaofei?Duan等人在Pseudoalteromonas?sp.?CY24中克隆的到了海藻酸裂解酶基因alyPI，在大腸桿菌中表達(dá)得到一個(gè)58KD的蛋白，催化活性達(dá)到了121.6U/mg。2012年，Hwan?Hee?Park等利用Sphingomonas?sp.?MJ-3的基因組構(gòu)建基因文庫，篩選得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并將其在大腸桿菌中表達(dá)，得到了一種對(duì)polyM?和polyG都有活性的雙功能酶。????

目前，國內(nèi)外所發(fā)現(xiàn)的海藻酸分解菌的種類眾多，主要分布于海洋細(xì)菌、土壤細(xì)菌和真菌等，但被成功克隆及異源表達(dá)的海藻酸裂解酶并不多，傳統(tǒng)方法一般利用海藻酸鈉分解菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)分離、純化得到海藻酸裂解酶，然而這種方法存在野生菌產(chǎn)酶量低、酶與降解產(chǎn)物難于分離，生產(chǎn)成本高等問題，成為酶解技術(shù)大量制備褐藻膠低聚糖的制約性技術(shù)難題，限制了海藻酸裂解酶的推廣使用，且大多數(shù)海藻酸裂解酶只能單一的利用PloyG或者PloyM，本發(fā)明從鞘氨醇單胞菌Sphingomonas?sp.ZH0中成功克隆出海藻酸裂解酶基因ZH0-I，并進(jìn)行了異源表達(dá)和蛋白純化的研究，將為進(jìn)一步研究海藻酸裂解酶分子機(jī)理，進(jìn)而推廣到工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶ZH0-I具有廣泛的底物特異性，既能利用PloyG又能利用PloyM為底物，是一種具有廣闊運(yùn)用前景的雙功能酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種鞘氨醇單胞菌的海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表達(dá)載體，該載體含有海藻酸裂解酶基因ZH0-I、Ptac啟動(dòng)子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS、GST標(biāo)簽，?ZH0-I基因的上游為Ptac啟動(dòng)子，Ptac啟動(dòng)子的下游為可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠ZH0-I基因起始密碼子上游的是一個(gè)GST標(biāo)簽序列，可生成易溶于水的融合表達(dá)蛋白，之后通過凝血酶可將GST標(biāo)簽切除而不影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)活性。

本發(fā)明中所述海藻酸裂解酶ZH0-I基因來源于鞘氨醇單胞菌Sphingomonas?sp.ZH0，其GenBank登錄號(hào)為JX944512.1。

本發(fā)明另一目的是將鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I的原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備海藻酸裂解酶ZH0-I中。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

1、鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-I的獲得和原核表達(dá)載體的構(gòu)建

（1）根據(jù)鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZH0-I基因（GenBank登錄號(hào)JX944512.1）編碼框序列和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物如下：?????????????????????