[發(fā)明專利]鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-III及其原核表達載體和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310132789.1
• 申請日: 2013-04-17
• 公開（公告）號: CN103173475A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 伊日布斯;過敏;錢龍;趙琳;唐麗薇;嚴金平
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N15/70;C12N9/88;C12R1/01
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-III及其高效表達鞘氨醇單胞菌ZH0海藻酸裂解酶ZH0-III蛋白的原核表達載體pGEX-4T-1-ZH0-II及其在制備海藻酸裂解酶ZH0-III蛋白中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

近年來，由于能源危機的加劇，環(huán)境問題日益突出，以海藻生物質(zhì)為原料生產(chǎn)生物能源越來越受到重視。大型海藻含有豐富碳水化合物，如海藻酸，開發(fā)相應(yīng)的技術(shù)可將其轉(zhuǎn)化為生物乙醇，產(chǎn)量高，且容易預(yù)處理。目前，海藻酸降解的方法可分為三大類：一類是化學(xué)降解法，目前廣泛采用的是酸水解法，這種方法操作步驟繁瑣，反應(yīng)條件劇烈。此外，還有過氧化氫氧化降解法；第二類是物理降解法，例如超聲降解海藻酸；第三類是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸條件溫和，過程可控，得率高，綠色安全，環(huán)境友好，作用機理明確，產(chǎn)物確定，可以根據(jù)具體目的產(chǎn)物要求選擇單一或組合使用不同底物專一性的酶制劑。?

目前，海藻酸裂解酶的生產(chǎn)大多是依靠海藻酸分解菌。雖然野生型海藻酸分解菌能有效的獲得一定量的酶蛋白，但產(chǎn)量很低成本較高，難達到實際應(yīng)用要求。因此，利用基因工程手段對海藻酸裂解酶基因進行異源表達是提高海藻酸裂解酶產(chǎn)量的最有效途徑。1993年，Boyd等首次克隆了Pseudomonas?alginovora海藻酸裂解酶的編碼基因algL并在大腸桿菌中進行了表達，其粗蛋白活性達到146U/mg。1996年Frederic等將Pseudomonas?alginovora中編碼海藻酸裂解酶的基因aly在大腸桿菌中表達，并且其催化活性達到97U/mg。2009年，Gaofei?Duan等人在Pseudoalteromonas?sp.?CY24中克隆的到了海藻酸裂解酶基因alyPI，在大腸桿菌中表達得到一個58KD的蛋白，催化活性達到了121.6U/mg。2012年，Hwan?Hee?Park等利用Sphingomonas?sp.?MJ-3的基因組構(gòu)建基因文庫，篩選得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并將其在大腸桿菌中表達，得到了一種對polyM?和polyG都有活性的雙功能酶。????

目前，國內(nèi)外所發(fā)現(xiàn)的海藻酸分解菌的種類眾多，主要分布于海洋細菌、土壤細菌和真菌等，但被成功克隆及異源表達的海藻酸裂解酶并不多，傳統(tǒng)方法一般利用海藻酸鈉分解菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)分離、純化得到海藻酸裂解酶，然而這種方法存在野生菌產(chǎn)酶量低、酶與降解產(chǎn)物難于分離，生產(chǎn)成本高等問題，成為酶解技術(shù)大量制備褐藻膠低聚糖的制約性技術(shù)難題，限制了海藻酸裂解酶的推廣使用，且大多數(shù)海藻酸裂解酶只能單一的利用PloyG或者PloyM，本發(fā)明從鞘氨醇單胞菌Sphingomonas?sp.ZH0中成功克隆出海藻酸裂解酶基因ZH0-III，并進行了異源表達和蛋白純化的研究，將為進一步研究海藻酸裂解酶分子機理，進而推廣到工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶ZH0-III具有廣泛的底物特異性，既能利用PloyG又能利用PloyM為底物，是一種具有廣闊運用前景的雙功能酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種鞘氨醇單胞菌的海藻酸裂解酶基因ZH0-III，該基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示或編碼如SEQ?ID?NO：2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。??

本發(fā)明另一目的是提供一種鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-III的原核表達載體pGEX-4T-1-ZH0-III，該載體含有海藻酸裂解酶基因ZH0-III、Ptac啟動子和終止子、細菌核糖體結(jié)合位點、GST標簽，Ptac啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，ZH0-III的N端帶有GST標簽，可生成易溶于水的融合表達蛋白，之后通過凝血酶可將GST標簽切除而不影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)活性。

本發(fā)明中海藻酸裂解酶基因ZH0-III基因來源于鞘氨醇單胞菌Sphingomonas?sp.?ZH0。?

本發(fā)明的另一目的是將鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶基因ZH0-III的原核表達載體pGEX-4T-1-ZH0-III應(yīng)用在制備海藻酸裂解酶ZH0-III蛋白中。?

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：?

1、鞘氨醇單胞菌海藻酸裂解酶ZH0-III基因的獲得及原核表達載體的構(gòu)建