[發明專利]一種有效硒生物檢測用細胞株GpSEGFP4及其構建方法

無效

• 申請號: 201310132610.2
• 申請日: 2013-04-16
• 公開（公告）號: CN103233033A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 孫梅好;徐麗珊;馬建輝;邱洋松;孫婧;孫愛;鄔丹妮;張冰倩
• 申請（專利權）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

1.一種有效硒生物檢測用細胞株GpSEGFP4的構建方法，其特征在于該細胞株的構建方法包括以下的步驟：

一、pSECIS1載體的構建

1.1）pK6Xho?I載體構建

定點突變pK6載體得到XhoI酶切位點，純化產物并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經測序驗證得pK6XhoI載體；

1.2）pK6Xho?I-CAT載體構建

氯霉素抗性基因進行PCR擴增，PCR產物于瓊脂糖凝膠中電泳，并割膠回收、純化目的條帶，用SmaI酶切pK6XhoI載體，純化后與氯霉素抗性基因連接，經菌液PCR與測序驗證得到pK6Xho?I-CAT載體；

1.3）pSECIS1載體構建

通過兩次聚合酶鏈式反應擴增得到SECIS序列，模板依次為pK6Xho?I-CAT載體、第一次PCR產物純化產物，將第二次PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化，用Xho?I和Hind?III分別酶切pCAT載體和SECIS?序列，純化酶切產物并連接，經菌液PCR和測序驗證得到pSECIS1載體；

1.4）pSECIS突變載體構建

對pSECIS1質粒進行定點突變，將純化產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，經測序驗證得到13個正確的突變體；

二、pCOLA-SelABC載體構建

2.1）pCOLA-SelC載體構建

PCR擴增SelC基因序列，純化PCR產物并與pMD18T?simple載體連接，測序驗證得到pMD18T?simple-SelC，用Nde?I、Kpn?I分別酶切PCOLAduet-1載體、sSelC質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測、割膠回收純化、連接并轉入DH5α感受態細胞，菌液PCR與測序驗證得到pCOLA-SelC載體；

2.2）pCOLA-SelABC載體構建

擴增SelAB基因序列，PCR產物純化、與pMD18T?simple載體連接、轉化到DH5α感受態細胞并測序驗證得到pMD-18T?simple-SelAB，BamH?I?和Hind?III雙酶切?pCOLA-SelC質粒與sSelAB基因序列，酶切產物電泳并割膠回收純化、連接并轉化入BL21感受態細胞，菌液PCR與測序驗證得到pCOLA-SelABC載體；

三、pSECIS突變體篩選

3.1）測定13種pSEICIS突變體及野生型的生長曲線

從Chl平板上挑取突變的13種pSECIS及野生型菌種的單菌落，LB培養基培養過夜，用含氨芐青霉素和硒酸鈉的LB培養基稀釋菌液至OD₆₀₀=0.05，37℃，振蕩培養，測定1、2、3、4、5、6、7?h七個時間點的菌液OD₆₀₀；

記錄分析在含硒和不含硒液體LB培養基中的生長繁殖速度；在不含硒的氨芐LB培養基中，只有不編碼硒蛋白的野生型pSECIS14正常生長，其他的生長均非常緩慢且無明顯區別；在0.5?mM硒酸鹽存在的情況下，野生型pSECIS14生長速度與不加硒的生長類似，而pSECIS4的生長速度明顯提高，基本是陽性對照野生型pSECIS14生長速度的一半左右，快于pSECIS1以及另外的SECIS突變；篩選獲得pSECIS4突變體；

四、pET23a-SECIS-GFP載體構建

4.1)?pET23a-SECIS-GFP載體構建

三次PCR擴增SEGFP序列在GFP?5’端引入UGA/SECIS序列，模板依次為GFP基因、第一次PCR產物、第二次PCR產物；純化PCR產物，第三次PCR產物末端加A，后純化并與pMD18T?simple載體連接，轉化進入大腸桿菌DH5α，篩選并測序驗證，得到pMD18T?simple-SECIS-GFP載體；Nde?I和Hind?Ⅲ?分別酶切sSEGFP和pET23a并連接、轉化，得到pSEGFP質粒并菌液PCR驗證；

4.2)?pET23a-SECIS4-GFP突變體構建

pET23a-SECIS-GFP質粒載體突變，將PCR產物純化后轉化進入DH5α感受態細胞并測序驗證；提取pSEGFP4質粒并與pSelABC質粒共轉化進入BL21感受態細胞獲得GpSEGFP4。