[發(fā)明專利]一種環(huán)境水體中CVA16病毒的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310132452.0
• 申請日: 2013-04-16
• 公開（公告）號: CN103305629A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周進宏;王曉昌;張崇淼;船水尚行;佐野大輔
• 申請（專利權(quán)）人: 西安建筑科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務所 61216
• 代理人: 史玫

1.一種環(huán)境水體中CVA16病毒的檢測方法，其特征在于，方法按下述步驟進行：

步驟一，樣品處理：

（1）病毒濃縮：首先在4℃條件下于V?mL的待檢測水樣中加入質(zhì)量百分比為8%的聚乙二醇和質(zhì)量百分比為2.3%的氯化鈉并混勻，接著將待檢測水樣在4℃條件下進行離心處理，棄上清液，用1mL超純水重懸沉淀得到病毒濃縮液，其中50≤V≤250；

（2）RNA提取：使用RNA提取試劑盒從病毒濃縮液中提取RNA；

（3）逆轉(zhuǎn)錄：將5μL的RNA、2μL的5×gDNA?Eraser?Buffer、1μL的5×gDNA?Eraser?Buffer和2μL的RNase?Free?dH₂O在42℃條件下反應2min得到反應液，將該反應液與4μL的5×Buffer、1μL的RT?Enzyme?Mix、1μL的RT?Primer?Mix和4μL的RNase?Free?dH₂O混合進行反應：先在37℃條件下反應15min；接著在85℃條件下反應5s，得到cDNA；

步驟二，定性檢測

（1）將2.5μL的10×Ex?Taq?Buffer、2μL的dNTP?Mixture、0.25μL的Ex?Taq、400nM的上游引物CVA16-F1、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步驟一所獲得的cDNA混合，接著用無菌超純水補足至25μL，在梯度PCR儀上進行擴增，同時以無菌超純水作為陰性對照；PCR反應條件為：

①95℃預變性5min；

②擴增循環(huán)35次，每輪循環(huán)的反應條件依次為：95℃，30s、56℃，30s、72℃，60s；

③在72℃延伸5min，反應產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物一；

其中：

上游引物CVA16-F1的核苷酸序列為：

5’-TGGGAYATTGAYTTGATGGG-3’；

下游引物CVA16-R的核苷酸序列為：

5’-GACATGAAGGGKACTGACACTTG-3’；

（2）將2.5μL的10×Ex?Taq?Buffer、2μL的dNTP?Mixture、0.25μL的Ex?Taq、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和0.2μL?PCR產(chǎn)物一混合，接著用無菌超純水補足至25μL，在梯度PCR儀上進行擴增，同時以無菌超純水作為陰性對照；其中的PCR反應條件為：

①95℃預變性5min；

②擴增循環(huán)35次，每輪循環(huán)的反應條件依次為：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s；

③在72℃延伸5min，擴增產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物二；

其中：上游引物CVA16-F2的核苷酸序列為：

5’-CAAACCRAAYGGTGAGYTAGT-3’；

（3）將所得的PCR產(chǎn)物二用含體積濃度2%Gel?Red核酸染料的瓊脂糖凝膠跑電泳，在凝膠成像儀下拍照，并將電泳條帶切割膠純化回收，得膠純化回收產(chǎn)物；

（4）采用雙脫氧終止法對所得膠純化回收產(chǎn)物進行核苷酸序列測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經(jīng)BLAST比對，當所測得的核酸序列與CVA16病毒基因相似度大于70%時，待檢測水樣中存在CVA16，繼續(xù)依次進行后續(xù)步驟三和步驟四，否則，待檢測水樣中不存在CVA16；

步驟三，標準品制備：

（1）第一輪PCR擴增：以步驟一獲得的cDNA為模板，利用上游引物CVA16-F1和下游引物CVA16-R為引物進行PCR擴增，得到第一輪擴增后的PCR產(chǎn)物；

（2）第二輪PCR擴增：以第一輪擴增后的PCR產(chǎn)物為模板，利用上游引物CVA16-F2和下游引物CVA16-R為引物進行PCR擴增，得到第二輪擴增后的PCR產(chǎn)物；

（3）將所得的第二輪擴增后的PCR產(chǎn)物用含體積濃度為2%的Gel?Red核酸染料的瓊脂糖凝膠跑電泳，在凝膠成像儀下拍照確認目的條帶，之后切割目的條帶并純化回收，得到目的片段回收產(chǎn)物，該目的片段回收產(chǎn)物的長度為m（bp）；

（4）將目的片段回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，采用藍白斑篩選法篩選出轉(zhuǎn)化進插入目的片段的載體的菌落，將陽性菌在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃條件下培養(yǎng)12～16小時得到菌液，接著用質(zhì)粒提取試劑盒從菌液中提取質(zhì)粒；其中LB液體培養(yǎng)基中卡那霉素的質(zhì)量濃度為50μg/mL；

（5）采用雙脫氧終止法對得到的質(zhì)粒的核苷酸序列進行測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經(jīng)BLAST比對，

當所測得的核酸序列與CVA16病毒基因相似度大于等于90%時，提取的質(zhì)粒為標準品，

當所測得的核酸序列與CVA16病毒基因相似度小于90%時，重復步驟（4）和步驟（5），直至提取的質(zhì)粒為標準品；

（6）檢測標準品的OD₂₆₀值n；

（7）利用（式1）計算標準品濃度C（copies/μL）：

C=n×50×10-9(2962+m)×2×330×6.02×1023]]>????（式1）

（式1）中：

2962為pMD19-T載體的長度，bp；

1OD₂₆₀=50μg/mL的雙鏈DNA；

330為1堿基的分子量，g/mol；

6.02×10²³為阿伏伽德羅常數(shù)，NA；

步驟四，定量檢測

（1）將步驟三得到的標準品依次稀釋至多個濃度梯度；利用實時熒光定量PCR分別檢測各濃度梯度樣品的Ct值和初始模版量x（copies），接著利用測得的七組Ct-x進行線性回歸分析，得到標準曲線方程：

Ct＝alogx+b????（式2）

（式2）中：a和b為標準曲線方程的系數(shù)；

（2）采用實時熒光定量PCR檢測步驟一所獲得的cDNA的Ct值：Ct₀；

（3）將Ct₀代入（式2）計算待檢測水樣中CVA16病毒的初始模板量x₀；待檢測水樣中CVA16病毒的含量C₁（copies/mL）為：

C1=x0(20/2)(60/5)(1000/140)V]]>????（式3）。