[發(fā)明專利]一種檢測小鼠痘病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310131617.2
• 申請日: 2013-04-16
• 公開（公告）號: CN103215382A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖庚富;張哲;鄭從義
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢珈創(chuàng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種檢測小鼠痘病毒的SYBR?Green?I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，同時(shí)還涉及SYBR?Green?I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的應(yīng)用，該SYBRGreen?I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒可高效方便的對小鼠細(xì)胞制品進(jìn)行定量檢測和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行小鼠痘病毒的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。

背景技術(shù)

小鼠痘病毒(Ectromelia?virus，ECTV)屬痘病毒科(Poxviridae)脊椎動(dòng)物痘病毒亞科(Chor?dopoxvirinae)正痘病毒屬(Orthpoxvirus)，是一種單一分子雙鏈DNA病毒，病毒粒子為磚形，大小為200nm×200nm×250nm，對乙醚抗性。其基因組序列與天花病毒有很大的相似性，因此《中華人民共和國藥典》規(guī)定對鼠源性生物制品必須檢測小鼠痘病毒。小鼠痘病毒感染有急性和慢性兩種形式，常見實(shí)驗(yàn)室烈性傳染性脫腳病就是由小鼠痘病毒急性感染引起，臨床表現(xiàn)為四肢、尾和頭部腫脹、潰爛、壞死甚至腳趾脫落為特征。慢性感染中主要為持續(xù)性感染，小鼠痘病毒慢性持續(xù)性感染小鼠沒有明顯臨床癥狀，是誘發(fā)脫腳病或產(chǎn)生病毒傳染的主要因素。因此，對實(shí)驗(yàn)小鼠慢性持續(xù)性小鼠痘病毒感染診斷，對控制小鼠痘病毒蔓延、防止脫腳病發(fā)生具有積極意義。目前檢測技術(shù)一般來說有血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三類：

1、血清學(xué)診斷技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)（IFA）、雙抗體夾心ELISA檢測等。但由于所有實(shí)驗(yàn)均用到抗血清和抗原免疫反應(yīng)，所以反應(yīng)時(shí)間長、材料多、準(zhǔn)備周期長，而且檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復(fù)性差。

2、生物學(xué)試驗(yàn)包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本較高、檢測周期長，耗費(fèi)大量生物資源和人力物力。

3、分子生物學(xué)診斷技術(shù)，即應(yīng)用PCR技術(shù)檢測小鼠痘病毒持續(xù)感染。PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。在上世紀(jì)90年代，國內(nèi)就有報(bào)道使用PCR技術(shù)建立檢測小鼠痘病毒的方法，最低檢出小鼠痘病毒DNA量為0.1pg。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以該方法無法定量起始的DNA或RNA拷貝數(shù)。近年發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluorogenetic?Quantitative?PCR,FQ-PCR)技術(shù)有靈敏度高、速度快、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。在基因表達(dá)水平分析(Nellema?nn?C,Vinggaard?AM,Dalagaard?M,et?al.Quantification?of?Antiandrogen?Effect?Determin?ed?by?Light?Cycler?Technology[J].Toxicology,2001,163:29-38)、病原體的定性(Bhudevi?B,Weinstock?D.Fluorogenic?RT-PCR?assay(TaqMan)for?Detection?and?Classification?of?Bovine?Viral?Diarrhea?Virus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量檢測(Kathy?F.J.Tan?g,Jun?Wang,Donald?V.Lightner.Quantitation?of?Taura?syndrome?virus?by?real-time?RT-P?CR?with?a?TaqMan?assay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;Birgit?Liss.Improve?d?quantitative?real-time?RT-PCR?for?expression?profiling?of?individual?cells[J].Nucleic?Ac?ids?Res.,2002,Vol.30No.17e89.Florence?KP,Glaucia?PB,Mireille?S,et?al.Quantitation?of?HCV?RNA?using?real-time?PCR?and?fluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已成為當(dāng)前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比較多的熒光定量PCR方法有SYBR?Green?I熒光染料法和TaqMan法，這兩種方法都具有靈敏度高、檢測速度快、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。M.SofiIbrahim等(2003)使用基于TaqMan探針的real-time?PCR法檢測天花病毒，最低檢測濃度能達(dá)到1fg/μL(25copies)，比普通PCR方法靈敏100倍。Luo?A-dong等(2008)使用SYBR?Green?I熒光染料建立山羊痘病毒熒光定量PCR檢測方法，最低能檢測700copies?DNA樣品。SYBR?Green?I熒光染料法和TaqMan探針法在靈敏度上相差不大。目前，國內(nèi)已有基于TaqMan探針技術(shù)的real-time?PCR檢測小鼠痘病毒的專利方法，“用于檢測小鼠脫腳病病毒的引物、探針及其方法（申請公布號CN102329889A）”。本發(fā)明所采用的基于SYBR?Green?I熒光染料技術(shù)的熒光定量PCR檢測方法其引物設(shè)計(jì)、合成更加簡便。