[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于微平板培養(yǎng)的污染物高效降解菌篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310129713.3
• 申請(qǐng)日: 2013-04-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103224885A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 席勁瑛;胡洪營(yíng);王智超;曹娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/00
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/00
• 代理公司: 西安智大知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61215
• 代理人: 賈玉健

1.一種基于微平板培養(yǎng)的污染物高效降解菌篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1，取含有相應(yīng)污染物高效降解菌的土壤、污泥或生物膜樣品，用無(wú)菌生理鹽水洗滌形成含有混合菌種的菌懸液；

步驟2，取上述含有混合菌種的菌懸液，在平板培養(yǎng)基上通過(guò)多次劃線(xiàn)分離得到多個(gè)單一純菌株，用無(wú)菌棉簽分別挑取菌落并用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行3次洗滌，得到多個(gè)含有待測(cè)單一菌種的菌液，調(diào)節(jié)菌液濃度使其在600nm下吸光度（OD600）為0.1-1.5；

步驟3，根據(jù)所需處理的難降解污染物溶解度配制飽和的基質(zhì)母液，并配制氯化銨和磷酸二氫鉀組成的無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH至所需范圍，其中無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液中氯化銨濃度為1.0-3.0g/L，磷酸二氫鉀濃度為1.0-2.0g/L；

步驟4，取某一種待測(cè)純菌菌液，將10mL菌液、10mL基質(zhì)母液和180mL無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液加入微平板上的某個(gè)微孔中，將同樣的組分加入相鄰的另外2個(gè)微孔中，針對(duì)同種待測(cè)純菌形成3個(gè)平行樣；

步驟5，重復(fù)步驟4的操作，取其他待測(cè)純菌菌液，按順序加入96孔微平板的相應(yīng)微孔中，在同一塊微平板上，同時(shí)設(shè)置3個(gè)不含菌液和3個(gè)不含基質(zhì)母液的對(duì)照微孔；

步驟6，在所有微孔中加入10mL濃度為5g/L的噻唑藍(lán)（MTT）顯色劑，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)微孔的OD600作為顯色前的初始值；

步驟7，將微平板蓋好，用封口膜密封后，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20-50℃，培養(yǎng)周期8-24h，每隔2-3h，取出平板用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)微孔的OD600值；

步驟8，在培養(yǎng)結(jié)束后，按照以下標(biāo)準(zhǔn)判斷不同菌株對(duì)污染物的降解能力，從而篩選出具有較強(qiáng)污染物降解能力的高效菌：

對(duì)照微孔內(nèi)OD600的增加值小于0.05，表明檢測(cè)結(jié)果有效，樣品沒(méi)有受到污染，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，加入菌液和基質(zhì)的微孔OD600的增加值越大，表明相對(duì)應(yīng)菌株對(duì)污染物的降解能力越強(qiáng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于微平板培養(yǎng)的污染物高效降解菌篩選方法，其特征在于，所述微平板為96孔微平板，單個(gè)微孔總體積300mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于微平板培養(yǎng)的污染物高效降解菌篩選方法，其特征在于，所述污染物為氯苯。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于微平板培養(yǎng)的污染物高效降解菌篩選方法，其特征在于，所述污染物為甲苯。