[發(fā)明專利]直接凝血酶抑制劑多肽及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310127718.2
• 申請(qǐng)日: 2013-04-14
• 公開（公告）號(hào): CN103421110A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莫煒;黃一農(nóng);于敏;張艷玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/815
• 分類號(hào): C07K14/815;A61K38/58;A61P7/02
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗凝多肽及其用途，尤其是直接凝血酶抑制劑的多肽及其用途。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)公開了直接凝血酶抑制劑?(DTIs)?的研制和開發(fā)在預(yù)防和治療靜脈和動(dòng)脈血栓、肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥?(HIT)?及急性冠脈缺血性綜合癥等心腦血管病發(fā)揮了巨大的作用。與傳統(tǒng)的抗凝劑?(肝素?(heparin)?和維生素?K?(VKAs))?相比，所述DTIs?具有明顯的優(yōu)勢(shì)；目前已知，已有注射用?DTIs?及口服?DTI?用于臨床治療。然而，實(shí)踐顯示，上述注射用?DTIs?及口服?DTI藥物的適應(yīng)癥尚屬單一，其中的每種?DTI?僅針對(duì)特定的病癥，且治療費(fèi)用昂貴；因此，開發(fā)新型注射用和口服用DTIs，在治療和預(yù)防血栓栓塞疾病方面具有廣闊前景。

本申請(qǐng)的發(fā)明人在之前研制了新型雙功能融合蛋白?RGD-hirudin?具有抗凝血酶、抗血小板聚集的雙重功能，屬一類生物技術(shù)新藥，現(xiàn)已進(jìn)入?I期臨床研究階段；但由于所述RGD-Hirudin?為一種蛋白質(zhì)/多肽類藥物，作為一種直接凝血酶抑制劑只能通過(guò)靜脈注射的給藥方式用藥，明顯限制了其臨床使用范圍。

因此，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種新型的直接凝血酶抑制劑的多肽，所述多肽應(yīng)具有抗凝活性，抗凝作用溫和、可控，且藥物作用靶點(diǎn)明確，對(duì)其它凝血因子沒有作用，能制備口服或皮下緩釋抗凝藥物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗凝多肽及其用途，尤其是直接凝血酶抑制劑的多肽。所述多肽具有抗凝活性，抗凝作用溫和、可控，且藥物作用靶點(diǎn)明確，對(duì)其它凝血因子沒有作用。

本發(fā)明的抗凝多肽能制備預(yù)防血栓性疾病藥物，所述藥物尤其可制成口服或皮下緩釋抗凝藥物。

本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)?RGD-hirudin?結(jié)構(gòu)功能研究，確定重組雙功能水蛭素與凝血酶相互作用關(guān)系，即?RGD-hirudin?的?C?末端與凝血酶?exosites?I?結(jié)合，N?末端與凝血酶活性位點(diǎn)結(jié)合，抑制凝血酶活性；然后，以?RGD-hirudin?的序列（“一種新型雙功能水蛭素及其制備方法和應(yīng)用”，2006?年，中國(guó)發(fā)明專利，專利號(hào)：01105798.X）為基礎(chǔ)，保留其功能氨基酸殘基，采用分子模擬軟件提供了具有抗凝活性的多肽Peptide?1和Peptide?2。

所述多肽Peptide?1的序列如SEQ?ID?NO:?1所示；

所述多肽Peptide?2的序列SEQ?ID?NO:?2所示。

本發(fā)明中，所述的多肽Peptide?1?和Peptide?2為在?RGD-Hirudin?的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)一步改造，將該分子截短，形成小分子多肽；

本發(fā)明中，利用畢赤酵母表達(dá)，經(jīng)純化、質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，Peptide?1的理論分子量為?3924.6730?Da?(35肽)?，Peptide?2的理論分子量為4023.7275?Da?(36肽)；

本發(fā)明中，Peptide?1經(jīng)?HPLC?測(cè)定的純度為82%，Peptide?2經(jīng)?HPLC?測(cè)定的純度為84%；所述Peptide?1蛋白含量?為?32mg，Peptide?2?蛋白含量為?40mg；

本發(fā)明中測(cè)定了所述多肽的抗凝血酶活性，結(jié)果顯示，所述Peptide?1?抗凝血酶比活性為7000ATU/mg，所述Peptide?2抗凝血酶比活性為6000ATU/mg；

本發(fā)明進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，所述Peptide?1?和?Peptide?2在?aPTT?在用藥后延長(zhǎng)，比用藥前延長(zhǎng)?1?倍左右，抗凝作用持續(xù)?2?h后，逐步恢復(fù)正常。

上述結(jié)果表明，所述多肽Peptide?1和Peptide?2可作為凝血酶直接抑制劑，具有抗凝血酶活性，其藥物作用靶點(diǎn)明確，對(duì)其它凝血因子沒有作用，可進(jìn)一步制備口服或皮下緩釋抗凝藥物；本發(fā)明所述的凝血酶直接抑制劑藥物能克服現(xiàn)有口服抗凝藥物存在的出血、血小板減少、導(dǎo)致抗凝治療失敗的缺陷，可用于預(yù)防血栓性疾病；

本發(fā)明所述多肽還可作為?DTIs?的候選藥物進(jìn)行深入研究，為開發(fā)出新型?DTIs?奠定基礎(chǔ)。

為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了本發(fā)明所述的多肽Peptide?1建模和Ramachandran?圖譜分析結(jié)果，其中，