[發明專利]狂犬病DNA疫苗的構建及應用

有效

• 申請號: 201310125911.2
• 申請日: 2013-04-12
• 公開（公告）號: CN103169963A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 步志高;王喜軍;葛金英
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所;哈爾濱維科生物技術開發公司
• 主分類號: A61K39/205
• 分類號: A61K39/205;C12N15/85;A61P31/14
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

技術領域

本發明涉及狂犬病疫苗領域。更具體地，本發明涉及一種作為狂犬病DNA疫苗的表達按哺乳動物密碼子偏嗜性優化的RV囊膜糖蛋白(G蛋白)基因的重組真核表達質粒。?

背景技術

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies?virus，RV)引起的一種人獸共患傳染病，在全球范圍內流行，以急性、漸進性和致死性腦炎為特征，一旦出現神經癥狀病死率幾乎高達100％^[1，2]。全球每年死于狂犬病的人數高達5.5萬，主要發生在亞洲和非洲的發展中國家^[3，4]。自2000年以來，我國狂犬病疫情又呈現快速回升的趨勢，2007年死亡人數高達3,300人^[5]，隨后略有下降，但仍維持在較高水平，2011年造成1,879人死亡^[6]，已經成為一個嚴重的公共衛生問題。據統計，99％以上人間狂犬病死亡病例因狂犬病犬咬傷所致^[1]。人間狂犬病控制最有效的措施是通過疫苗接種，從源頭上控制犬狂犬病。傳統的狂犬病弱毒疫苗成本低廉，但存在毒力殘留或致病性回復突變的安全隱患；滅活疫苗安全、有效，但成本昂貴^[7，8]。因此，研制安全、有效，成本低廉的動物狂犬病疫苗，仍具現實意義。?

DNA疫苗免疫動物后，可同時誘導體液免疫和細胞免疫，可保護動物抵抗病原體的攻擊。同時，DNA疫苗易于構建，大量制備工藝簡單，生產成本低廉，便于保存，無需冷凍運輸，因而引起研究人員的廣泛關注^[9，10]。?

狂犬病病毒(Rabies?virus，RV)為彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lssavirus)成員^[11]?？袢〔《灸夷さ鞍?RVG)是病毒的受體結合蛋白和主要毒力因子之一，決定著病毒侵入神經系統或組織的路徑和致病力，也是誘導機體保護性免疫反應的主要抗原^[12]。本研究構建了表達哺乳動物密碼子優化的RVG基因的重組真核表達質粒pCAGG-RVG，并對其在靶動物犬的免疫原性進行了評估。?

發明內容

本發明構建了表達按哺乳動物密碼子偏嗜性優化的RVG蛋白(RVG)基因的重組真核表達質粒pCAGG-RVG。間接免疫熒光試驗及蛋白印跡結果表明，重組RVG在pCAGG-RVG轉染BHK細胞獲得正確表達。將pCAGG-RVG按500μg劑量經肌肉注射途徑免疫比格犬，間隔4周以相同劑量、途徑加強免疫一次，并于初次免疫前、后不同時間檢測血清RV中和抗體。結果，pCAGG-RVG一次免疫即可誘導顯著的中和抗體反應，二次免疫中和抗體滴度表現出顯著地增強效果。二次免疫后，中和抗體滴度經過短暫的下降，即保持持續的平穩，至初次免疫后第54周，7只免疫犬中和抗體滴度平均為2.88IU，且全部高于0.5IU，即全部高于對強毒攻擊保護的最低中和抗體滴度要求。綜上，pCAGG-RVG具有預防狂犬病的潛力，是一種有希望的狂犬病候選疫苗。?

具體地，本發明提供以下各項：?

1.一種狂犬病DNA疫苗，所述狂犬病DNA疫苗包含表達按哺乳動物密碼子偏嗜性優化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重組真核表達質粒。?

2.根據第1項所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述按哺乳動物密碼子偏嗜性優化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因具有如SEG?ID?No.1所示的序列。?

3.根據第1項所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述表達按哺乳動物密碼子偏嗜性優化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重組真核表達質粒具有如SEG?ID?No.2所示的序列。?

4.具有如SEG?ID?No.2所示的序列的重組真核表達質粒用作狂犬病DNA疫苗的用途。?

5.具有如SEG?ID?No.2所示的序列的重組真核表達質粒在制備狂犬病DNA疫苗中的用途。?

附圖說明

圖1：間接免疫熒光檢測RVG蛋白在pCAGG-RVG轉染BHK細胞中的表達。A：pCAGG-RVG轉染的BHK細胞；B：RV弱毒疫苗株ERA感染的BHK細胞；C：pCAGGS轉染的BHK細胞。?