[發明專利]基于重組融合抗原蛋白的γ-干擾素夾心ELISA檢測方法

有效

• 申請號: 201310124911.0
• 申請日: 2013-04-11
• 公開（公告）號: CN103333251A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 徐賢坤;熊毅;劉棋;龍劍明;馮淑萍;胡巧云;付薇;馬琳;黃勝斌
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543;C12R1/32
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

技術領域

本發明屬于醫學檢驗測定技術領域，特別是涉及基于重組融合抗原蛋白的γ-干擾素夾心ELISA檢測方法。?

背景技術

牛結核?。╰uberculosis,TB）是由牛結核分枝桿菌引起的慢性消耗性疾病，呈世界性分布。世界動物衛生組織（OIE）將牛結核病列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。一直以來，人們習慣認為牛結核病在水牛中很少發生，但1998~2000年南非克羅格國家公園爆發了以水牛為自然宿主的牛結核病，公園南部的水牛感染率達42%，中部地區的感染率為21%，給人們提示了水牛感染結核病的嚴重性。近年來我國南方奶水牛業的快速發展，尤其是廣西、云南、貴州、四川等地掀起了飼養奶水牛的熱潮。由于水牛奶干物質含量高達18.4%，比黑白花牛奶的含量高出1/3多；其中乳脂率含量為7.9%，高出黑白花牛奶一倍多，水牛奶在人們的日常生活中的地位越來越重要。隨著水牛集約化養殖程度的提高，水牛養殖密度的增加，尤其是從國內外引種交易的頻繁以及檢疫的不嚴格，增加了水牛結核病發生的可能性，全國水牛結核病的流行具有上升與蔓延趨勢。我國亦不斷有水牛結核病發生的報道，但對水牛結核病的檢測由于沒有適合的方法而一直是沿用牛結核病的檢測方法，均不適用于水牛結核病的檢測。?

到目前為止，我國國標推薦的牛結核病診斷方法只有細菌學檢查和結核菌素(PPD)皮內變態反應。細菌學檢出率低，培養周期長，不適于大規模普查。皮內變態反應的應用最為廣泛，該法技術要求不高，但工作量大，檢出時間長，操作麻煩，許多因素都可以降低該方法的敏感性和特異性。γ-干擾素（IFN-γ）主要是由抗原、有絲分裂素等一些細胞因子活化T淋巴細胞和NK細胞產生，是免疫調節活性最強的一類干擾素。經結核桿菌抗原致敏的T淋巴細胞，在再次遇到相同抗原時，將在短時間內產生IFN-γ，因此高水平的IFN-γ即可表明有結核桿菌感染。國外Wood等首先將抗原特異性的IFN-γ試驗用于牛結核病的檢測，澳大利亞選用牛IFN-γ試驗為牛結核病根除計劃的大規模篩選試驗，已于1997年12月宣布消滅了牛結核病；此外，愛爾蘭、新西蘭等國也批準牛IFN-γ試驗為正式試驗。?

經過對檢索有關于牛結核病檢測試劑的研究報道，國內牛結核病檢測的現有技術情況如下：（1）華中農業大學、中國農業大學對抗牛IFN-γ試驗單克隆抗體制備及ELISA檢測方法的建立進行了研究；揚州大學建立了牛γ-干擾素抗原捕獲ELISA檢測方法，建立了競爭抑制ELISA方法和膠體金試紙條檢測牛γ-干擾素。但揚州大學建立的方法采用牛分支桿菌抗原PPD作為刺激物，臨床診斷中難以與禽分支桿菌等環境分支桿菌感染區分開，特異性較差。（2）中國農業大學申請的專利（申請號201110034194.3）牛分支桿菌檢測試劑使用單個重組蛋白MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的混合物，中國農科院北京畜牧獸醫研究所申請的專利（申請號201210147678.3）牛結核病檢測試劑亦使用單個重組蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4，單個抗原混合使用在抗原表達與純化、相互配比及方法的標準化等方面均存在明顯不足；中國農科院哈爾濱獸醫研究所申請的專利(申請號200510005002.0)使用牛分枝桿菌抗原MPB70、MPB83和ESAT6融合蛋白用于牛結核病的檢測，忽視了CFP-10和ESAT-6是緊密異二聚體結構的特點，在檢測靈敏度方面略有欠缺。γ-干擾素水平成為了牛結核病的判斷標準，而國內對γ-干擾素檢測方面的研究存在一定的局限性，例如靈敏度和特異性差、檢測周期長、檢測方法僅限用于黑白花奶牛、不適于大規模普查等問題。?

本發明人通過對1500余頭奶水牛進行PPD皮內變態反應臨床試驗，其結果顯示，2歲以下的水牛術前皮厚平均值在20mm左右，3~5歲的水牛術前皮厚平均值在17.5mm左右，5歲以上水牛的平均值在18.5mm左右。用PPD作為抗原進行水牛皮內變態反應，皮厚差大于2mm的水牛占到20%左右，其中皮厚差大于4mm的水牛占到10%左右，按照國標（GB/T18645-2002.動物結核病診斷技術）其檢出的陽性率異常高。然而，PPD檢測陽性水牛用IFN-γELISA試驗復檢，其陽性率通常不足5%。該檢測結果讓我們認為直接參照現行國標用PPD進行水牛結核病檢測，以2mm皮厚差以下判斷陰性的標準是不適用于水牛結核病檢測的。有關報道顯示，奶水牛以及水牛群已經處于結核病感染的狀態，急需開發出一種可用于快速檢測牛全血中γ-干擾素分泌水平的方法，實現水牛結核病的防控。?

發明內容