[發明專利]同時適用于大腸桿菌與枯草芽孢桿菌的啟動子

無效

• 申請號: 201310123915.7
• 申請日: 2013-04-11
• 公開（公告）號: CN103160511A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 楊明明;趙辛;陳玉林
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/75;C12N9/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體而言，涉及一種同時適用于大腸桿菌與枯草芽孢桿菌的啟動子及其應用。

背景技術

啟動子是一段RNA聚合酶識別、結合和起始轉錄的特定DNA序列，通常位于基因的上游。一旦RNA聚合酶定位并結合在啟動子上即可啟動轉錄過程，因此啟動子是基因表達調控的重要順式元件，對一個基因(或轉錄單元)的轉錄是否開始以及在什么時候開始起到決定性的控制作用，它與RNA聚合酶以及其他蛋白輔助因子等反式元件的相互作用是啟動子調控模式的實質。

在基因工程中，常需構建高水平表達異源蛋白的表達載體，啟動子對外源基因的表達水平影響極大，使其成為基因工程表達載體的重要元件。因此，研究啟動子功能對于了解生物生長發育、探討生物適應環境的機制及實現外源基因在轉基因生物中的高效表達等均有重要意義。啟動子的調控在轉錄環節中也占有十分重要的地位，故研究啟動子的功能序列對于基因表達調控機制的研究意義重大。目前，在表達載體上應用最廣泛的大腸桿菌天然啟動子有四種，即Ptac、Plac、PT7和PλL。酵母菌可控性啟動子表達系統有半乳糖啟動子(gal)、酸性磷酸酶啟動子(pho)等。為了獲得更強的啟動子，人們利用已知的啟動子重新構建新的雜合啟動子以滿足不同外源基因的表達要求。實驗表明，用雜合啟動子可以提高基因的表達效率。

在枯草芽孢桿菌基因工程研究中，最常用的誘導性啟動子是spac和xyl。spac是枯草芽孢桿菌噬菌體SPO1與大腸桿菌乳糖操縱子融合的啟動子，在IPTG誘導下可以高效表達；xyl啟動子由巨大芽孢桿菌術糖基因的表達元件構建而成。xyl由自己編碼的xyR阻遏蛋白嚴格控制表達，與啟動子spac相比，其調控更嚴謹，誘導效率更高。這2個啟動子在枯草芽孢桿菌中應用很廣，但是它們也有自己的缺點，其誘導物IPTG、木糖的價格較高，而且IPTG有毒性，因此它們在實際應用中有很大的局限性。

毫無疑問，分離獲得新的強啟動子是枯草芽孢桿菌生物技術應用和研究領域的熱點。并且，來源于其他芽孢桿菌的啟動子有可能在枯草芽孢桿菌中具有價值和潛力。本發明從從地衣芽孢桿菌基因組DNA中篩選到一個在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中有強轉錄活性的片段，該啟動子包含了luxS基因的調控序列。目前尚無關于地衣芽孢桿菌luxS基因調控元件及其在大腸和枯草中應用的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種雙啟動子，其能夠同時適用于大腸桿菌與枯草芽孢桿菌。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案：

本發明一方面涉及一種啟動子，其特征在于所述啟動子具有SEQ?IDNO.1所示的序列。

本發明另一方面還涉及含有上述啟動子的載體。

本發明另一方面還涉及上述載體在大腸桿菌和/或枯草芽孢桿菌中表達的應用，優選的，所述的應用為在大腸桿菌和/或枯草芽孢桿菌中同時表達。

本發明公開了一個從地衣芽孢桿菌中分離的強啟動子片段，該啟動子在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中都表現了高活性，為枯草芽孢桿菌的重組蛋白表達提高了有力的啟動元件。

附圖說明

圖1：雙啟動子結構示意圖和序列：A：SD和bgaB代表核糖體結合位點和β-半乳糖苷酶編碼基因；ylybCDS和luxsCDS代表ylyb和luxs基因的編碼區；

B：SD代表核糖體結合位點；-10和-35指代原核啟動子的保守序列；bgaB代表β-半乳糖苷酶編碼基因；Sau3AI代表限制性消化酶。

圖2：是雙啟動子在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中熱穩定性β-半乳糖苷酶表達量：縱坐標為熱穩定性半乳糖苷酶活性；淺色柱和深色柱分別代表E.coli?DH5α(pShuttle-Fusl)和Bacillus?subtilis?PY79(pShuttle-Fusl)的熱穩定性半乳糖苷酶的酶活。酶活單位為Mill?U/mL粗酶液。

圖3：SDS-PAGE檢測雙啟動子對熱穩定性β-半乳糖苷酶的表達：pLux和pDET-1為陰性對照，pShuttle-Hyb和pShuttle-Fusl為克隆啟動子在枯草芽孢桿菌中介導的熱穩定性半乳糖苷酶的的表達。Marker為蛋白分子量標準，單位為KD。

具體實施方式

以下結合實施例詳細描述本發明內容：

實施例1：啟動子克隆與序列