[發明專利]一次性鑒別羊肉、雞肉、鴨肉、豬肉的PCR檢測方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201310123666.1
• 申請日: 2013-04-11
• 公開（公告）號: CN104099405A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 張英杰;劉月琴;陳睿賾;劉彥琴;郭云霞;李雪梅;楊佳棟;錫建中
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.為了鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，利用動物種屬間特異性較強的線粒體DNA序列，針對每種動物分別設計各自的種屬特異性引物，分別以羊、豬、雞、鴨4種動物的全基因組DNA為模板，通過PCR反應得到4種長度各不相同的特異性擴增片段，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，4種長度不同的條帶可以在電泳圖中分辨出來。4種動物對應的4對引物序列為：?

羊：?

S-1:5′-GGCTCTCTCCTAGGCATTTGCTT-3′?

S-2:5′-AGTTGTCTGGGTCTCCGAGTAA-3′擴增片段大小為667bp?

豬：?

P-1:5′-ACCCAGCAAGCCCAGAATCAACCG-3′?

P-2:5′-CGAGATTGTGCGGTTATTAATGAGTCG-3′擴增片段大小為196bp?

雞：?

C-1:5′-AATCGCAGGTATTACTATCATCCAC-3′?

C-2:5′-GGTGAGTATGAGAGTTAAGCCCAG-3′擴增片段大小為148bp?

鴨：?

D-1:5′-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3′?

D-2:5′-GCCTAGTTCGGGGGTTGGTA-3′擴增片段大小為226bp。?

2.為了能夠一次性的鑒別羊肉、鴨肉、豬肉、雞肉，以及混合過的肉制品中的這四種肉的成分，反復試驗得到4種單PCR反應共同的反應條件為：?

預變性94℃5min?

循環94℃30s?

????58℃30s?

????72℃30s共30個循環?

延伸72℃10min冷卻，電泳檢測?。

3.為達到四重PCR反應的最佳擴增效果，將S-1、S-2、P-1、P-2、C-1、C-2、D-1、D-2共8種引物的原液（濃度各為10μmol/L）按照1:1:1:1:1:1:2:2的比例混合得到混合引物，即得到的混合引物中S-1、S-2、P-1、P-2、C-1、C-2、D-1、D-2的濃度為1、1、1、1、1、1、2、2μmol/L。PCR反應體系為：?

總體積20μl，2×PCR反應液10μl（含Taq?DNA聚合酶、4種dNTP等，可以直接由市售的現有產品充當），混合引物2.0μl，模板DNA1.0μl，去離子水補至20μl。?