[發(fā)明專(zhuān)利]一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310123401.1
• 申請(qǐng)日: 2013-04-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103224996A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張以芳;馬志亮;范斌;柴俊;孫亭亭;鄒豐才;劉岳;柳桐;楊潔
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 昆明今威專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

1.一種熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，包括用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬瘟病弱毒疫苗病毒含量的特異性引物、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、確定實(shí)驗(yàn)的成立標(biāo)準(zhǔn)、確定陽(yáng)性或陰性的判定標(biāo)準(zhǔn)，其具體特征如下：?

（1）引物特征：

SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2能特異性擴(kuò)增豬瘟兔化弱毒疫苗病毒的cDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為197bp，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)濃度的質(zhì)粒；

SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4能特異性擴(kuò)增包含于SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2擴(kuò)增產(chǎn)物片段之內(nèi)的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為143bp，SEQ?ID?NO：5為T(mén)aqman熒光探針，在其5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’標(biāo)記猝滅熒光基團(tuán)TAMRA，用于建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)未知樣品；

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法：

提取豬瘟兔化弱毒疫苗的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模板；以SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α內(nèi)，提取質(zhì)粒DNA，獲得豬瘟兔化弱毒疫苗檢測(cè)用的標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒；

將制備的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作10倍梯度稀釋?zhuān)韵♂屢簽槟０澹M(jìn)行熒光定量PCR，采集熒光信號(hào)，使用Bio-Rad?iQ5軟件繪制出實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得其產(chǎn)物Tm值；

（3）實(shí)驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)：

若陽(yáng)性對(duì)照的Ct值＜32，陰性對(duì)照的Ct值＞35，電腦繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)相關(guān)度大于95%，反應(yīng)效率在80%～120%之間，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、有效，實(shí)驗(yàn)成立；

（4）判定陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)：

在實(shí)驗(yàn)成立的前提下，待測(cè)樣品的Ct值＜35，判為陽(yáng)性；待測(cè)樣品的Ct值＞35則判為陰性。