[發明專利]轉植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物、探針及其在PCR檢測中的應用無效

申請號：	201310122007.6	申請日：	2013-04-09
公開（公告）號：	CN103215261A	公開（公告）日：	2013-07-24
發明（設計）人：	孫紅煒;張廣遠;楊淑珂;李凡;徐曉輝;高瑞;路興波	申請（專利權）人：	山東省農業科學院植物保護研究所
主分類號：	C12N15/11	分類號：	C12N15/11;C12Q1/68;G01N21/64
代理公司：	濟南圣達知識產權代理有限公司 37221	代理人：	楊琪
地址：	250100 山***	國省代碼：	山東;37
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摘要：
搜索關鍵詞：	轉植酸酶基因玉米 phya2 特異性引物探針及其 pcr 檢測中的應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及轉植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物、探針及其在PCR檢測中的應用，屬于分子生物學領域。

背景技術

玉米是我國重要的飼料加工原料，其所含總磷的50%以上是以植酸形式存在，動物幾乎不能消化利用，同時，植酸是抗營養因子，嚴重影響動物對鈣、鎂、鐵、鋅等元素的吸收。植酸酶是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或鹽)的一類酶的總稱，能水解植酸最終釋放出無機磷。在動物飼料中添加外源植酸酶可以改良磷酸鹽的生物利用度，消除植酸的抗營養作用，不僅能減少磷在環境中的排泄，降低農業生態的負擔，同時也能減少動物飼料中無機磷的添加，緩解我國磷資源匱乏的局面。

利用植物生物反應器生產植酸酶的研究由來已久，比如來源于WT煙曲霉的植酸酶和經過改造的熱穩定植酸酶已經在小麥和大麥中成功表達；來源于無花果曲霉的植酸酶也已在煙草，苜蓿和馬鈴薯葉片中成功表達。我國科學家通過分離來自黑曲霉的植酸酶基因phyA2并構建到玉米特異表達載體上，得到了27個表達植酸酶并能穩定遺傳的轉基因玉米純合系。其種子中植酸酶活性均在1000U／kg以上，最高達到120000U／kg，完全達到中國飼料工業標準(1kg玉米添加1000u植酸酶)的要求，可以替代傳統工業生產的植酸酶添加劑。以玉米為載體生產的植酸酶直接用于飼料加工，實現了以環保、節能的農業生產方式生產“綠色磷”的夢想，具有巨大的產業優勢和應用前景。

我國將轉基因植物的研究分為五個階段：實驗研究階段、中間試驗階段、環境釋放階段、生產性試驗階段、申請安全證書與商業化生產階段。轉植酸酶基因玉米是我國自主研發，具有自主知識產權的玉米品系，目前，該轉基因玉米于2009年11月獲得農業部正式頒發的轉基因生物生產應用安全證書，成為我國首例獲得安全證書的糧食作物，也是國際上首例研制成功的轉植酸酶基因玉米，標志著轉植酸酶基因玉米在我國即將進入大規模商業化生產階段。根據《農業轉基因生物標識管理辦法》規定，轉基因產品必須進行標識管理，因而需要加強轉植酸酶基因玉米相關的檢測技術。

發明內容

本發明的目的是提供一種轉植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物、探針及其在PCR檢測中的應用。

本發明采取的技術方案為：

一種轉植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物，正向、反向引物序列分別為：

phyA2-1F:5'-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3'，如SEQ?ID?NO.1所示，

phyA2-2R:5'-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'，如SEQ?ID?NO.2所示。

一種轉植酸酶基因玉米phyA2基因特異性探針，序列為：

phyA2-P:FAM-5'-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3'-Eclipse，如SEQ?ID?NO.3所示。

轉植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物在定性檢測玉米及其相關產品是否含有轉植酸酶基因玉米成分中的應用，方法如下：

（1）提取待檢測樣品基因組DNA，并以此為模板，利用phyA2-1F和phyA2-2R引物組合進行PCR擴增；

（2）上述PCR擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物；若存在擴增產物，則待檢測樣品為含有轉植酸酶基因玉米或其相關產品；若不存在擴增產物，則待檢測樣品中不含轉植酸酶基因玉米成分。

步驟（1）所述的PCR擴增為：95℃5min預變性；94℃30s,58℃30s,72℃30s,35個循環；72℃延伸7min。