[發明專利]霍亂弧菌的實時熒光PCR檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310119606.2
• 申請日: 2013-04-08
• 公開（公告）號: CN103160605A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 曾靜;張西萌;張琳;張蕾;魏海燕;馬丹
• 申請（專利權）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明屬于檢驗檢疫領域，涉及霍亂弧菌的實時熒光PCR檢測試劑盒及其檢測方法，具體涉及一種應用免疫磁珠技術進行霍亂弧菌檢測的方法。

背景技術

霍亂是由霍亂弧菌（Vibrio?cholera，VC）引起的烈性腸道傳病，該病起病急、傳播快、涉及范圍廣，屬國際檢疫傳染病，在我國被列為甲類傳染病之一，是主要食源性致病微生物之一，時時威脅著人類并給人類帶來危害。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食經口傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進入小腸后，依靠鞭毛的運動，穿過粘膜表面的粘液層，通過菌毛作用粘附于腸壁上皮細胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經過短暫的潛伏期后便急驟發病。該菌不侵入腸上皮細胞和腸腺，也不侵入血液，在局部繁殖和產生霍亂腸毒素，此毒素作用于粘膜上皮細胞與腸腺使腸液過度分泌，從而患者出現上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣”并含大量弧菌，此為本病典型的特征。目前，該菌是多數進出口水產品必檢的致病菌之一。

目前檢測食品中致病微生物的方法主要以傳統方法為主，即分離鑒定方法，該方法所需時間長，一般情況下需要5～7天，有時達到10～15天，很難滿足快速鑒定的需要；實時熒光PCR（RT-PCR）技術是近幾年發展起來的基于檢測遺傳物質的技術，該技術已經應用在微生物檢測、基因表達、新生物醫藥的篩選等領域，該技術具有高特異性、高靈敏度的特點，所需檢測時間短，整個PCR過程只需2個小時左右，經大量的科研實踐證明，在檢測特異性和靈敏度方面，實時熒光PCR技術與傳統方法相當，但是極大地縮短了檢測時間，整個檢測過程從5～7天時間，縮短到2～3天，節約了時間，縮短了貨物在口岸的停留時間，最根本的保護了廣大消費者的利益。

納米磁珠是運用納米技術，在傳統生物學和現代分子生物技術的基礎上，開展生物科學、醫學等方面的研究。在分子、細胞和個體水平上為食源性致病菌檢測和疾病的診斷等方面提供新材料、新技術和新方法。納米磁珠在生物樣品的分離分析中有著重要應用價值：（1）高效富集：納米磁珠比表面積大，顯著增加反應界面能夠高效富集生物樣品；（2）非常有效的去除PCR反應中的抑制劑：以現在的檢測方法，不同種的致病微生物采用不同的增菌液，增菌液中的添加劑往往對PCR反應有較強的抑制作用，采用磁珠分離的方法可以非常有效的去除抑制劑；（3）可操作性：納米磁珠具有超順磁效應，外加磁場能夠快速對其進行移動和分離；（4）標記性質：生物分子標記方法簡單、可靠。抗體是一類重要的生物活性材料，廣泛應用于檢驗檢疫、疾病診斷、藥物篩選、國防、航天、司法鑒定、食品衛生、環境監測及軍事偵檢等領域，已成為發展新型免疫檢測技術和推動檢測檢疫產業快速發展的重要資源。本發明應用與抗霍亂弧菌單克隆抗體偶聯的納米磁珠，即免疫磁珠（Immunomagnetic?Beads，IMB），其具有選擇性好，特異性強，能起到富集濃縮細菌的作用，有效避免或減少漏檢，且可去除食品樣品中抑制PCR反應的成分。將免疫磁珠分離（Immunomagnetic?separation，IMS）與RT-PCR技術相結合，建立IMS-RT-PCR檢測方法，可以極大地提高檢測效率。并由此開發了霍亂弧菌IMS-RT-PCR檢測試劑盒，具有廣闊的應用前景。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一組特異性強、靈敏度高的用于檢測霍亂弧菌的RT-PCR寡核苷酸。

本發明要解決的第二個技術問題是提供一種操作簡單、結果準確的霍亂弧菌的RT-PCR檢測試劑盒。

本發明要解決的第三個技術問題是提供一種霍亂弧菌的IMS-RT-PCR檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了一組檢測霍亂弧菌的寡核苷酸，是依據NCBI收錄號DQ772779（DnaA）對應的基因序列設計的，由序列表SEQ?ID?No.1至序列表SEQ?ID?No.3所示堿基序列組成；其中序列SEQ?ID?No.1為正義引物（P1），序列SEQ?ID?No.2為反義引物（P2），序列SEQ?ID?No.3為熒光探針（P），探針的5’端標記報告熒光基團為FAM（6-羧基熒光素），3’端標記淬滅熒光基團為TAMRA。詳見表1。

表1引物序列