[發(fā)明專利]一種格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310118576.3
• 申請日: 2013-04-03
• 公開（公告）號: CN103215281A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鞠建華;張云;黃洪波;劉靜;馬俊英
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/53;C12N9/04;C12P19/44;C12R1/465
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一組角環(huán)素（angucycline）抗生素，格瑞克霉素（grincamycin）和P-1894B(vineomycin?A1)的生物合成基因簇及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

格瑞克霉素和P-1894B是一類由角環(huán)素為骨架連接5個糖配基所組成的抗生素，具有很好的抗各種腫瘤細胞和革蘭氏陽性細菌的活性，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。角環(huán)素是指通過聚酮生物合成途徑形成十聚酮鏈而產(chǎn)生的具有角四環(huán)即苯并蒽環(huán)（Benz[a]anthracene）結(jié)構(gòu)并不含糖配基的化合物。角環(huán)素類化合物分別于1965及1966年被Dann和Kunstmann?and?Mitscher等人首次報道過。微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成是由多酶體系參與的，這些多酶體系中的各個酶系按照一定的組織結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)起作用。聚酮化合物均是由多酶體系PKS催化酰基-CoA活化的底物之間的重復(fù)脫梭縮合而合成的。所有角環(huán)素類化合物都是由II型PKS形成的具有廣泛生物活性及化學(xué)多樣性的芳香多聚酮類化合物，其生物活性主要包括抗腫瘤、抗菌、抗病毒、酶抑制、血小板凝集抑制以及免疫調(diào)節(jié)等。由于角環(huán)素結(jié)構(gòu)骨架及其糖配基數(shù)量和種類上的多樣性，目前已發(fā)現(xiàn)天然的角環(huán)素類化合物總數(shù)超過170多個。目前有許多典型的角環(huán)素類型化合物的生物合成被報道，如：urdamycins,landomycins,gaudimycins,simocyclinone,oviedomycin。

角環(huán)素類天然產(chǎn)物在過去十幾年里由于其顯著的生物活性及多樣的糖基團而引起了許多科學(xué)家的關(guān)注。除了從自然界中獲得典型的天然角環(huán)素類化合物，通過組合生物合成的手段對角環(huán)素類化合物生物合成基因簇進行改造也已經(jīng)獲得一些新的具有顯著生物活性的角環(huán)素類衍生化合物。另外，可以通過對化合物生物合成途徑的了解，對一些化合物結(jié)構(gòu)進行修飾，得到目標的化合物，或者通過對一些調(diào)控基因進行改造，可以達到提高目標化合物產(chǎn)量的目的。由于存在角環(huán)素化合物的毒性及可溶性問題，目前并沒有該類化合物進入臨床試驗藥物的報道，所以可以通過組合生物合成的手段，對該類化合物進行定向修飾，從而能夠得到具有用藥前景的角環(huán)素類化合物。

組合生物合成是近20年發(fā)展起來的一種合成天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性，用以發(fā)現(xiàn)和發(fā)展藥物的新方法。它尤其適合于化學(xué)方法難以合成的那些復(fù)雜的生物大分子化合物。由于分子遺傳工程、基因工程的發(fā)展，以及基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等學(xué)科研究的不斷深入，諸多與微生物代謝相關(guān)的生物合成基因和蛋白功能被認知與掌握。通過生物信息學(xué)和微生物遺傳學(xué)手段可確定基因簇中的各模塊或結(jié)構(gòu)域的功能，如將這些模塊或結(jié)構(gòu)域進行多種“自由”組合就可能產(chǎn)生核心環(huán)合成和功能基團各異的新型“非天然”天然產(chǎn)物。組合生物合成和代謝工程在篩選和發(fā)展新型藥物方面日益成為生物、化學(xué)和醫(yī)藥界關(guān)注的重點。基于聚酮和聚肽類天然產(chǎn)物的獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)和良好生物活性，研究它們的生物合成機制，將為合理化遺傳修飾生物合成途徑獲得結(jié)構(gòu)類似物提供遺傳和生物化學(xué)的基礎(chǔ)，實現(xiàn)利用現(xiàn)代生物學(xué)和化學(xué)的技術(shù)手段在微生物體內(nèi)進行藥物開發(fā)的目的。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇。

本發(fā)明的格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇來源于鏈霉菌Streptomyces?lusitanus?SCSIO?LR32，其特征在于，該生物合成基因簇是從包含有整個格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因簇的cosmid179F中測序獲得的，該格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第3722～40612位的堿基序列所示，包含30個基因，具體為：

(1)負責格瑞克霉素和P-1894B的角環(huán)素骨架合成的基因，即gcnH、gcnI、gcnJ共3個基因：

gcnH位于基因簇核苷酸序列（SEQ?ID?NO.1，下同）第11220-12500個堿基處，長度為1281個堿基對，編碼酮基合成酶，426個氨基酸；

gcnI位于基因簇核苷酸序列第12497-13717個堿基處，長度為1221個堿基對，編碼II型PKS鏈延伸因子模塊，406個氨基酸；

gcnJ位于基因簇核苷酸序列第13794-14063個堿基處，長度為270個堿基對，編碼酰基載體蛋白，89個氨基酸；

(2)負責格瑞克霉素和P-1894B的角環(huán)素骨架后修飾的基因，即gcnA、gcnC、gcnF、gcnK、gcnL、gcnM、gcnP、gcnT、gcnU共9個基因：