[發明專利]一種優秀冰雪運動員血液mRNA反轉錄方法

無效

• 申請號: 201310117899.0
• 申請日: 2013-04-08
• 公開（公告）號: CN103160498A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 胡萍;黃綏平;王飛;熊慧;孫婷婷;關偉軍
• 申請（專利權）人: 哈爾濱體育學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及優秀冰雪運動員血液mRNA反轉錄技術，屬于運動生理學、運動生化學、分子生物學交叉學科領域。

背景技術

RNA反轉錄(reverse?transcription)是以RNA為模板，通過反轉錄酶，合成DNA的過程，是DNA生物合成的一種特殊方式。1970年Temin等在致癌RNA病毒中發現了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為核板，根據堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序(其中V與A配對)合成DNA。這一過程與一般遺傳信息流轉錄的方向相反，故稱為反轉錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉錄酶(reverse?transcriptase)。后來發現反轉錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞中也有反轉錄酶。反轉錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物，在tRNA3′術端上，按5′→3′方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementary?DNA，cDNA)，它與RNA模板形成RNADNA雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成過程。

由于目的基因的轉錄產物易于制備，可將mRNA反向轉錄形成DNA用以獲得目的基因。通過RNA反轉錄技術獲得目的基因已成為研究特定基因表達的常用的方法，基因在不同個體不同細胞間及不同生長階段的選擇性表達決定了生命活動的多樣性，如發育與分化、衰老與死亡、內環境穩定、細胞周期調控等。探求基因表達的差異為我們揭示生命個體某種能力的差異提供依據。

隨著我國體育事業的快速發展，優秀冰雪運動員的不斷涌現，為運動醫學的深入研究帶了契機，如果我國運動科學工作者充分利用現代分子生物學技術，了解優秀冰雪運動員相關運動基因的結構與功能，探明運動能力表型的基因標記，并定位這些基因，那么對冰雪運動員的運動能力預測、評定以及科學選材系統的建立將有十分重要的意義。

目前，在基因定位及標記的技術層面上，多是通過基因多態分析、微衛星DNA等遺傳標記的反向遺傳學定位克隆策略，先獲得某一表型在染色體上的定位，再在候選區選擇已知基因，進行相關基因的篩選，以獲得cDNA及全基因，而mRNA反轉錄技術則是構建cDNA文庫的先行技術。優秀冰雪運動員外周血液樣品易于采集，而且量少，不會對運動員產生損傷，血液mRNA的提取簡易，反轉錄合成的cDNA的插入片段范圍大，可用于cDNA文庫構建，為優秀冰雪運動員運動相關基因進一步的研究提供豐富的材料。

因此，優秀冰雪運動員血液mRNA反轉錄可為運動相關基因研究提供技術基礎，能夠推進運動醫學分子領域的研究，進一步揭示優秀成績的分子原因，從而推動祖國冰雪運動乃至整個體育事業的發展。

發明內容

本發明提供簡易、高效的優秀冰雪運動員血液mRNA反轉錄方法。

為實現上述目的，本發明采取以下實驗方案：

本發明涉及優秀冰雪運動員血液mRNA的反轉錄，具體步驟為：

(1)采集優秀冰雪運動員外周血液樣本；

(2)改良Trizol法提取血液mRNA。

(3)改良磁珠法提純血液mRNA；

(4)血液mRNA反轉錄。

其中，步驟(1)選取現役冰雪運動員為樣本采集對象；步驟(2)改良Trizol法以氯仿-異戊醇抽提和異丙醇沉淀為特征；步驟(3)改良磁珠法純化mRNA以高鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液漂洗生物素標記的Oligo(dT)探針配合低鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液漂洗生物素標記的Oligo(dT)探針-磁珠雜交體為特征，其中，高鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液為2×溶液，低鹽氯化鈉-檸檬酸鈉鹽溶液為0.1×溶液，使用高鹽3×SSC漂洗生物素標記的Oligo(dT)探針能夠洗去部分非特異性結合的探針，使用低鹽0.1×SSC漂洗生物素標記的Oligo(dT)探針-磁珠雜交體能夠增加核酸鏈的嚴緊性，使得RNA/DNA之間的排斥力增加，得到純度更高的mRNA。

具體實施方式

1、mRNA的提取

(1)取優秀冰雪運動員新鮮血液3ml；

(2)取Rnase的2mL離心管，加入900μlTrizol，加入30μl5mol/L冰醋酸和0.5ml新鮮全血，蓋上離心管，震蕩搖勻，室溫靜置5min。

(3)加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)，上下顛倒混勻10次，室溫靜置3min。4℃12000r/min離心15min；