[發明專利]用改變烏頭酸酶調控元件的細菌發酵生產L-蘇氨酸的方法

有效

• 申請號: 201310117440.0
• 申請日: 2013-04-07
• 公開（公告）號: CN103173505A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 馬吉銀;溫廷益;陳金龍;梁勇;劉樹文;魏愛英;楊立鵬;孟剛;任瑞
• 申請（專利權）人: 寧夏伊品生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12P13/08
• 分類號: C12P13/08;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
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技術領域

?本發明屬于氨基酸發酵領域，具體而言，本發明涉及發酵生產l-蘇氨酸的方法及其衍生的方法和應用，和可以用在這些方法和應用中的細菌等。

背景技術

通過產l-蘇氨酸的細菌（如，埃希氏菌屬的大腸桿菌和棒桿菌屬的桿狀細菌）發酵來生產l-蘇氨酸已經得到了產業化應用。這些細菌，可以是從自然界分離的細菌，也可以是通過誘變或基因工程改造獲得的細菌，或者兩者兼而有之。當前的文獻報道中，通過基因工程改造的注意力主要集中在AKIII、thrR等基因上（參見中國專利94102007和99121353等），未見為了L-蘇氨酸生產而關注烏頭酸酶（如，烏頭酸酶A）及其編碼基因。

烏頭酸酶是三羧酸循環中的一個酶，該酶催化兩步化學反應，分別為檸檬酸轉化為烏頭酸以及烏頭酸轉化為異檸檬酸。目前已知在埃希氏菌中，acnA基因（其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示）編碼烏頭酸酶A，但是可能是由于其代謝距離最終的l-蘇氨酸產物太遠，中間代謝分支太多且復雜，而在l-蘇氨酸發酵中一直未引起人們的重視。

本發明人經過長期研究和實踐，尤其憑借了一些運氣，偶然發現acnA基因的調控元件的改造能夠有助于提高l-蘇氨酸的產量；然而，現有技術要么通過增加拷貝和/或定點突變導入表達量和/或酶活性提高的有益的酶基因，要么通過敲除不利的基因以使之酶活性和/或表達量消失，但是與之不同的是，本發明人發現，acnA基因的調控元件不能簡單地提高或敲除，尤其是敲除后acnA基因的不表達使得細菌生長困難，難以實際應用，因此開發了新的針對acnA基因的調控元件的方法，以此來提高l-蘇氨酸的產量，而且該方法與現有改造的大量高產L-蘇氨酸的細菌的染色體改造位點沒有沖突，可以疊加提高的效果，從而在實踐上可用于細菌發酵生產l-蘇氨酸。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供新的發酵生產l-蘇氨酸的方法及其相關的方法，包括相對于未改造細菌提高l-蘇氨酸的發酵生產量的方法，改造的細菌在發酵生產l-蘇氨酸中的應用，改造的細菌在相對于未改造細菌提高l-蘇氨酸的發酵生產量的應用，和/或，改造細菌的方法等。另外，本發明還提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、載體和/或細菌等。

???????具體而言，在第一方面，本發明提供了發酵生產l-蘇氨酸的方法，其包括：

（1）改造細菌染色體上acnA基因的野生型的調控元件，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失；和，

（2）用步驟（1）改造而得到的細菌發酵生產l-蘇氨酸。

???????在本文中，術語“改造”指的是是相應被改造的對象發生變化，從而達到一定的效果。改造位于染色體上的調控元件的頻度遠小于改造位于染色體上的基因的頻度，但是兩者進行改造的技術手段基本一致，包括但是不限于，誘變、定點突變、和/或同源重組，優選是后兩者。這些技術手段廣泛記載于分子生物學和微生物學文獻中，有許多甚至已經商品化了。在本發明的具體實施方式中，根據同源重組的原理，采用Addgene公司商品化的pKOV質粒系統來進行改造，將未改造細菌染色體上acnA基因的野生型的調控元件，改造成能夠使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失的新的調控元件。因此，在本文文中，優選改造是通過同源重組進行的改造。

???????本發明人經過長期研究發現，使得acnA基因所編碼的烏頭酸酶A的表達量消失，將造成細菌本身生長困難，甚至無法生長/繁殖。因此，本發明的“改造”要相對于未改造的細菌，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失，優選使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低20%~95%，更優選降低50%~90%，如降低65%、70%或80%。

???????相應地，本發明還提供了其他應用或方法。例如，在第二方面，本發明提供了提高l-蘇氨酸的發酵量的方法，其包括：

（1）改造細菌染色體上acnA基因的野生型的調控元件，使改造獲得的細菌的烏頭酸酶A的表達量降低但不消失；和，

（2）用步驟（1）改造而得到的細菌發酵產生l-蘇氨酸。