[發明專利]一種改良的酶聯免疫測定試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310117062.6
• 申請日: 2013-04-07
• 公開（公告）號: CN104101711A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 黃若磐
• 申請（專利權）人: 廣州瑞博奧生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

技術領域

本發明涉及一種酶聯免疫檢測試劑盒及檢測方法，尤其涉及一種改良的酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

酶聯免疫吸附檢測（Enzyme-linked?immunosorbent?assay，簡稱ELISA）是利用抗原抗體之間的特異性結合特性，對受檢樣本進行檢測。由于結合于固相載體(一般為塑料96孔酶孔板)上的抗原或抗體仍具有免疫活性，因此通過它們之間的特異性結合，再配合酶對于底物的催化，可產生可見光或者非可見光的信號，因而可顯示特定抗原或抗體是否存在，并可利用顯色的深淺進行定量分析。根據待測樣品以及結合方式的不同，可設計出各種不同類型的ELISA檢測方法，主要有三明治法（sandwich）、間接法（indirect）以及競爭法（Competitive）這三種方法。

細胞因子（cytokine）是由細胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質的統稱。在免疫應答過程中，細胞因子在免疫調節、炎癥應答、腫瘤轉移等生理和病理過程中起重要作用。細胞因子的檢測不僅是基礎免疫研究的有較手段，同時在臨床疾病診斷、病程觀察、療效判斷及細胞因子治療監測方面具有重要價值。由于細胞因子在人體中含量很低，因此如何提高檢測靈敏度顯得十分重要。

影響ELISA檢測靈敏度的主要因素是標準曲線斜率以及信噪比。為了提高靈敏度，可以通過增強抗原與抗體結合能力，對信號進行放大，對背景（噪音）進行降低等方法。但由于抗體與抗原結合的能力在抗體生產出來后就不受控制，好的抗體往往可遇不可求，所以提高靈敏度的主要手段是放大信號以及降低背景。

由于對抗體進行生物素標記方法簡單，試劑價格低廉，且對抗體活性影響較小，同時生物素可以和抗生物素蛋白鏈菌素特異性的高效結合，故目前在夾心法ELISA中，大多采用生物素標記的抗體作為檢測抗體，再通過與抗生物素蛋白鏈菌素偶聯的酶催化底物產生結果來進行信號放大。同時，在對檢測樣品進行稀釋的時候，目前一般通過在樣品稀釋液里添加動物血清或者牛血清白蛋白（BSA），以提高信號檢測特異性，降低背景。

因為血清是一種潛在的傳染源，目前采用牛血清蛋白或者動物血清的方法都會存在潛在的生物學風險。同時，動物血清獲取不易，基本上為一次性獲取，故應用成本較高。而且，直接使用動物血清還會存在批次間差異。

目前采用酶標記的鏈親和素一般都只連接有一個辣根過氧化物酶，雖然通過催化底物的方式實現了信號放大，但在抗原濃度低、抗體-抗原-抗體-酶夾心物形成量少的情況下，信號放大效果仍不理想。

發明內容

針對現有技術中的上述技術問題以及不足之處，本發明的目的在于提供一種改良的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒能降低普通酶聯免疫檢測方法的結果背景，具有靈敏度高、品質穩定、成本低廉等優點。

本發明所述的一種改良的酶聯免疫檢測試劑盒，包括：抗體預包被的微孔板、標準品、樣品抗體稀釋液、生物素標記的檢測抗體、20倍濃縮洗液、增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素、底物，以及終止液；其中，所述的樣品抗體稀釋液是含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸鹽緩沖液。

根據本發明所述的酶聯免疫檢測試劑盒的進一步特征，所述的增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素是聚集多個辣根過氧化酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素。

本發明的另一個方面提供了采用所述的改良的酶聯免疫檢測試劑盒的檢測方法。

本發明所述的改良的酶聯免疫檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：用含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸鹽緩沖液的樣品抗體稀釋液將標準品或者樣品進行稀釋；將稀釋后的標準品或者樣品加入到抗體預包被的酶孔板中，使標準品或樣品中的待檢測抗原特異地被酶孔板中的抗體所捕獲并固定在固相表面；再加入含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸鹽緩沖液的樣品抗體稀釋液稀釋后的生物素標記的檢測抗體，所述抗體特異地結合所測抗原，形成抗體-抗原-抗體夾心三文治；然后加入增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素，使其與檢測抗體上的生物素標記結合；加入底物，進行底物顯色反應；再加入終止液終止反應；測定待檢測的抗原的濃度。

根據本發明所述的檢測方法的進一步特征，所述的增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素是聚集多個辣根過氧化酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素。

與傳統的酶聯免疫測定方法相比，本發明采用了獨創的樣品抗體稀釋液以及增強的抗生物素蛋白鏈菌素。本發明能降低普通酶聯免疫檢測方法的結果背景，提高靈敏度，尤其在檢測較低濃度細胞因子樣品時，對試劑盒的性能有較大提升，而且本試劑盒品質穩定、成本低廉，利于推廣應用。

具體實施方式