[發(fā)明專(zhuān)利]基于液相芯片檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310116510.0
• 申請(qǐng)日: 2013-04-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103173569A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹偉力;鄭小龍;方紹慶;賈鵬;劉寧;王穎
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的引物對(duì)、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用，具體涉及基于液相芯片檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的方法。

背景技術(shù)

傳染性造血器官壞死癥（IHN）是被列為《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類(lèi)傳染病、寄生蟲(chóng)病名錄》的二類(lèi)傳染病，是《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》規(guī)定的三類(lèi)疫病，是國(guó)際獸疫局OIE名錄中的重要疫病。

魚(yú)傳染性造血器官壞死癥是由傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)引起的。IHNV為RNA病毒，是彈狀病毒科成員，大約120-180nm長(zhǎng)。IHNV可侵害多種海水和淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，在歐、美、日、韓及部分亞洲國(guó)家流行，可通過(guò)魚(yú)體及所產(chǎn)卵、精液、尿、糞便以及污染的飼料、水等傳播，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)造成致命打擊，危害非常嚴(yán)重。

目前魚(yú)類(lèi)病毒的檢測(cè)方法主要包括細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)、免疫學(xué)診斷技術(shù)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三大類(lèi)。細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)主要包括采用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、組織病理切片及電鏡觀察，其操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、且靈敏度低。免疫學(xué)診斷技術(shù)主要包括免疫熒光檢測(cè)、免疫點(diǎn)雜交，具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，但步驟相當(dāng)繁瑣，不適宜對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)。分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），快速、靈敏，但是需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并通過(guò)溴化乙錠染色觀察結(jié)果，溴化乙錠是致癌物，對(duì)人體和環(huán)境有危害，交叉污染問(wèn)題比較嚴(yán)重。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供輔助鑒定傳染性造血器官壞死癥病毒的引物對(duì)、引物探針組合物以及它們的應(yīng)用，具體涉及基于液相芯片檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的方法。

本發(fā)明提供的輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的特異引物對(duì)，由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。

本發(fā)明還提供了輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的引物探針組合物，由所述特異引物對(duì)和探針T1組成；所述探針T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。

所述特異引物對(duì)或所述引物探針組合物可用于制備輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的試劑盒。

所述特異引物對(duì)或所述引物探針組合物可用于輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的試劑盒，包括所述特異引物對(duì)或所述引物探針組合物。

本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟：以待測(cè)病毒的總RNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；如果所述RT-PCR擴(kuò)增得到了擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病毒為候選的傳染性造血器官壞死病毒；如果所述RT-PCR擴(kuò)增沒(méi)有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病毒為候選的非傳染性造血器官壞死病毒。所述擴(kuò)增產(chǎn)物的大小可為100-250bp之間，具體可為126bp。所述待測(cè)病毒可為傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒或病毒性神經(jīng)壞死病病毒。

本發(fā)明還保護(hù)另一種輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟：以待測(cè)病毒的總RNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后與所述探針T1進(jìn)行雜交，如果雜交結(jié)果為陽(yáng)性待測(cè)病毒為候選的傳染性造血器官壞死病毒，如果雜交結(jié)果為陰性待測(cè)病毒為候選的非傳染性造血器官壞死病毒。所述待測(cè)病毒可為傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性胰臟壞死病病毒或病毒性神經(jīng)壞死病病毒。

所述輔助鑒定傳染性造血器官壞死病毒的方法具體包括如下步驟（液相芯片法）：

（1）以待測(cè)病毒的總RNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；

（2）制備微球懸液

①將表面羧基化的熒光編碼微球漩渦振蕩20s，取75μL（約含3×10⁶個(gè)微球）置于1.5mL離心管中，10000g離心1min，棄上清；

②在步驟①的離心管中加入50μL0.1mol/L?N-甲基咪唑水溶液（pH4.5），漩渦混合，超聲波處理30-60秒（400W的功率,每超聲9秒停6秒）；

③在步驟②的離心管中加入1.0nmol所述探針T1，漩渦混合；

④在步驟③的離心管中加入2.5μL碳二亞胺溶液（碳二亞胺溶液的制備方法：將10mg碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現(xiàn)用現(xiàn)配）充分混勻，室溫避光孵育30min；

⑤在步驟④的離心管中加入2.5μL碳二亞胺溶液（碳二亞胺溶液的制備方法同上）充分混勻，室溫避光孵育30min；