[發明專利]單管熒光PCR技術檢測GJB2基因235delC突變的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201310116474.8
• 申請日: 2013-04-07
• 公開（公告）號: CN104099402A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 王寶恒;史桂芝
• 申請（專利權）人: 王寶恒
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種采用實時熒光聚合酶鏈反應技術(FQ-PCR)檢測GJB2基因233-235位點C缺失(235delC)突變的方法，其特征在于以GJB2基因第235位點堿基缺失處設計特異性野生型探針及突變型探針，野生型及突變型探針分別被標記上不同顏色的熒光，同時在GJB2基因第235位點堿基兩側設計特異性擴增引物，對于檢測樣本，依據野生型與突變型探針在PCR擴增中產生的熒光顏色不同來判斷樣本是否存在突變。

2.一種用實時熒光PCR方法檢測GJB2基因235delC突變的試劑盒，其特征在于試劑盒主要包括：PCR反應液，陰性質控品，陽性質控品。

3.根據權利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，GJB2基因第235nt區域上游設計正向擴增引物，在下游設計反向擴增引物，其長度均為10-30bp之間的核苷酸序列，能夠擴增出含有GJB2基因233-235nt區域的長度為50-700bp的核苷酸片段，優選地，正向引物(SEQ?ID?NO：1)及反向引物(SEQ?ID?NO：2)為能擴增出含有GJB2基因233-235nt區域60-150bp片段的特異性核苷酸序列。

4.根據權利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，GJB2基因第205-265nt區域設計野生型探針及突變型探針，優選地，在GJB2基因第215-255nt區域進行探針設計，其長度均為10-30bp之間的核苷酸序列。兩種探針均覆蓋GJB2基因233-235nt區域，其中野生型探針(SEQ?ID?NO：3)針對GJB2基因235野生型位點，突變型探針(SEQ?ID?NO：4)針對GJB2基因235delC突變位點。

5.根據權利要求1、2、3、4所述的方法及其試劑盒，其特征在于，PCR反應液中包含熒光檢測物質。熒光檢測物質為熒光探針，其中探針5’端標記熒光發生基團，3’端標記熒光淬滅基團。

6.根據權利要求1、2、3、4、5所述的方法和試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括下列內容：PCR反應液含有1XPCR?Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去離子水、正向型引物、反向型引物、野生型熒光探針、突變型熒光探針。

7.根據權利要求1、2所述的方法及權利6所述的試劑盒，其特征在于待檢測靶核酸樣品來自被檢測者的血液、唾液、羊水細胞或其它人體組織；陽性質控品為經過測序檢驗結果為GJB2?235位點純合突變型的組織、血液、或細胞系提取的DNA或含有相應序列的PCR產物或質粒載體；陰性質控品為蒸餾水、純水、生理鹽水、鮭魚精子DNA；陰性質控品也可以為經過測序檢驗結果為GJB2?235位點野生型的組織、血液、或細胞系提取的DNA或含有相應序列的PCR產物或質粒載體。