[發(fā)明專利]雞pcdh1基因部分片段的克隆、表達(dá)及多克隆抗體的制備

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310115237.X
• 申請(qǐng)日: 2013-04-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103194476A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李永海;李萌;陳國(guó)榮;王琳;陳紅麗;劉涌濤;趙興華;李超英;豐慧根;林俊堂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C12N15/11;C07K16/18;C07K16/06;G01N33/68;C12R1/19
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多克隆抗體制作技術(shù)，具體而言，就是利用設(shè)計(jì)的特定引物，通過(guò)相應(yīng)手段原核表達(dá)和純化目的蛋白，免疫動(dòng)物制作免疫血清，進(jìn)而通過(guò)實(shí)驗(yàn)闡明本抗血清用作pcdh1基因蛋白表達(dá)檢測(cè)的可行性。

背景技術(shù)

原鈣粘蛋白（Protocadherins，pcdh）是一種帶有親同種抗原粘附活性的跨膜蛋白，是鈣粘蛋白超家族中最大的亞群。pcdh主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約有60多種pcdh在大腦中表達(dá)。現(xiàn)有的研究表明，pcdh對(duì)神經(jīng)元突觸的發(fā)育有直接的影響。pcdh分子不僅可以作為粘附分子加強(qiáng)神經(jīng)突觸的連接，而且還可以作為受體在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起到一定作用。此外，pcdh參與細(xì)胞遷移和細(xì)胞分選，神經(jīng)元回路和神經(jīng)突觸的建立以及細(xì)胞存活和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。一些pcdh基因的突變已經(jīng)與一些人類(lèi)疾病聯(lián)系在了一起。比如，pcdh12功能的缺失會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈管壁的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，通過(guò)啟動(dòng)子的高度甲基化使pcdh17沉默表達(dá)會(huì)導(dǎo)致pcdh17腫瘤抑制活性的消失，說(shuō)明pcdh17的表達(dá)可以抑制食管癌的發(fā)生；臨床研究表明pcdh21等位突變可導(dǎo)致隱形視網(wǎng)膜色素變性；pcdh19的突變或者缺失會(huì)造成女性患家族性的癲癇；Koppelman等發(fā)現(xiàn)pcdh1是氣道高反應(yīng)的易感基因，又有研究表明pcdh1是引發(fā)哮喘的并且在呼吸道上皮組織表達(dá)的一個(gè)新的易感基因。雖然目前我們對(duì)pcdh的功能有了一定的了解，但是有些pcdh在胚胎發(fā)育及病理過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)及作用機(jī)制仍然不清楚。

本發(fā)明所述以雞源pcdh1（GeneBank收錄號(hào)NM_001045827）為研究對(duì)象，建立制備其多克隆抗體的方法以及制備雞源pcdh1的多克隆抗體和用于其表達(dá)檢測(cè)，迄今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。?

本發(fā)明目的在于，通過(guò)克隆、異源表達(dá)和純化pcdh1特定肽段的融合蛋白，作為抗原免疫動(dòng)物，制作pcdh1多克隆抗體，利用此抗體檢測(cè)雞pcdh1基因在各種生理病理?xiàng)l件下的表達(dá)，進(jìn)而提供一種pcdh1的表達(dá)檢測(cè)試劑用于基礎(chǔ)及醫(yī)療實(shí)踐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明首先根據(jù)雞pcdh1基因（GeneBank收錄號(hào)NM_001045827）的序列，先用Globplot2.3軟件分析pcdh1的跨膜區(qū)，然后再用DNAStar?引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)pcdh1膜內(nèi)區(qū)段引物：

????上游引物5’-GGGATCCTCCTGCCTGGCCCTGTGGTTCCTCT-3，

????下游引物5’-GGAATTCCTCGGGGCCAGCCAGCAGTTCATA-3’；?

上游引物和下游引物分別添加BamHI?和?EcoRI酶切位點(diǎn)（下劃線所示）。

從一周左右的雞胚腦組織中提取總RNA，RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板PCR擴(kuò)增膜外目的片段。將目的片段連入表達(dá)載體，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

本發(fā)明目的之一在于提供一種雞源pcdh1特異性多克隆抗體。

本發(fā)明的目的之二在于提供制備該克隆抗體的方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供克隆表達(dá)該pcdh1肽段的序列引物，該引物還可以用于RT-PCR來(lái)檢測(cè)該基因的mRNA表達(dá)水平。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種雞源pcdh1特異性多克隆抗體，其特征在于所述的特異性多克隆抗體是將pcdh1氨基酸序列的第33位到204位氨基酸殘基組成的多肽特異性結(jié)合。

上述的特異性多克隆抗體是將pcdh1第33位到204位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的cDNA序列構(gòu)建到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2TK中，得到重組質(zhì)粒pGEX-2TK-pcdh101，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到可溶表達(dá)帶有雞源pcdh1第33位到204位氨基酸殘基的多肽融和蛋白。

上述的特異性多克隆抗體是將多肽融和蛋白作為抗原免疫動(dòng)物而獲得。