[發明專利]用生物反應器擴增重組腺病毒的優化工藝方法

有效

• 申請號: 201310114752.6
• 申請日: 2013-04-03
• 公開（公告）號: CN103160478A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 陳科達;吳潔;王一虎;姜云水;莊昉成;金素鳳;高孟;張鋒;李劍波;陳剛;毛子安;毛江森
• 申請（專利權）人: 浙江普康生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 高麗敏;韓介梅

1.一種用生物反應器擴增重組腺病毒的優化工藝方法，其特征在于用聚纖維紙片載體利用生物反應器擴增人胚腎細胞HEK293，建立腺病毒復制擴增的工藝流程，對5型腺病毒復制擴增體系全面適應的條件下，在細胞培養階段用含10%的胎牛血清的DMEM培養基，培養細胞6-7天后換液成無血清培養基，吸附腺病毒2.5-3.5小時，加入3-5%胎牛血清，繼續培養20小時，棄去全部培養液，并用磷酸緩沖液PBS沖洗去除血清，全部換成無血清培養基加0.25%水解乳蛋白，靜止再吸附1.5-2.5小時以利于病毒再感染正常細胞，同時每20小時補充2g/L的葡萄糖，采用批式收獲換液的方式，使優化工藝達到較高的病毒滴度。

2.根據權利要求1所述的用生物反應器擴增重組腺病毒的優化工藝方法，其特征在于：具有如下步驟：1）在生物反應器內加入生長液，接種HEK293細胞，批次換液培養6-7天，密度達到5×10⁶個/ml以上，接種重組腺病毒，34℃靜止吸附2.5-3.5小時，連續培養擴增病毒，每20小時左右批次換液收獲；（2）100小時后，細胞每日葡萄糖消耗低于1.6g/L，用低滲緩沖液破細胞，反復沖洗三次，收獲細胞內病毒；（3）用300k中空纖維柱濃縮20-50倍，用于進一步純化。

3.根據權利要求1所述的生物反應器擴增重組腺病毒的優化工藝方法，其特征在于：生物反應器所用聚纖維紙片載體為150克。

4.根據權利要求1所述的生物反應器擴增重組腺病毒的優化工藝方法，其特征在于：重組腺病毒接種量即感染復數MOI為20-50。

5.?根據權利要求1所述的生物反應器擴增重組腺病毒的優化工藝方法，其特征在于：接毒后收獲方式采用批式收獲，同時補充相同體積的維持液，收獲時間點為40、60、80和100小時。

6.根據權利要求1所述的用生物反應器擴增重組腺病毒的優化工藝方法，其特征在于：生物反應器物理參數設定：（1）細胞培養階段pH7.1-7.5、溫度37℃、溶氧50-80%；（2）接毒后，pH7.15-7.25、溫度35℃、溶氧50-70%。

7.根據權利要求1所述的生物反應器擴增重組腺病毒的優化工藝方法，其特征在于：收獲液用低滲緩沖液破細胞釋放胞內病毒，用300k中空纖維柱濃縮20-50倍。