[發明專利]一種N-糖基化木聚糖酶XYN11C1及其基因和應用

有效

• 申請號: 201310114513.0
• 申請日: 2013-04-03
• 公開（公告）號: CN103215241A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 姚斌;石鵬君;杜彥龍;羅會穎;楊培龍;王亞茹;孟昆;柏映國;黃火清;趙珩
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種N-糖基化木聚糖酶XYN11C1及其基因、包含該基因的重組載體和應用。

背景技術

畢赤酵母（Pichia?pastoris）表達系統是近年來被公認的最有效的外源蛋白真核表達系統之一，其具有諸多優點，被廣泛的用于生產重組蛋白。畢赤酵母表達系統具有操作簡易、生長迅速、易于培養、表達菌株穩定、分泌效率高、表達生物量高、生產成本低、易于工業化生產等優點，相比原核表達系統，其具有對外源蛋白進行翻譯后修飾等特點，如糖基化、蛋白磷酸化、脂酰化、二硫健的形成等(Daly?R,Hearn?MT.Expression?of?heterologous?proteins?in?Pichia?pastoris:a?useful?experimental?tool?in?protein?engineering?and?production.J?Mol?Recognit.2005,18(2):119-138.)。畢赤酵母表達的外源酶蛋白多為糖蛋白，主要為N-連接糖蛋白和少量O-連接糖蛋白。與哺乳動物中的復雜型N-糖鏈結構不同，酵母的N-糖鏈末端結構為高甘露糖型，N-糖基化多糖大小基本一致，利于后期糖鏈結構和含量的解析及不同糖基化位點的生物功能比較分析。目前，已有相關文獻報道了不同位點的N-糖基化對酶的分泌、空間構象、催化能力、底物特異性，最適pH和穩定性具有重要影響，而且不同位點的N-糖基化功能具有多樣化（Skropeta?D.The?effect?of?individual?N-glycans?on?enzyme?activity.Bioorg?Med?Chem.2009,17(7):2645-2653.）。

木聚糖是植物半纖維素中最豐富的一類物質，廣泛存在農業副產品中，如玉米芯、秸稈、麩皮等，存在著豐富的木聚糖，這些物質通常是被焚燒或者丟棄，造成嚴重的資源浪費和環境污染，如何有效地利用這些可再生資源一直是國內外的研究熱點。木聚糖酶主要分布于第5、8、10、11、30和43家族。目前研究最多的木聚糖酶來源于第10和第11家族，其中第10家族屬于GH-A家族，這一類家族的酶都具有典型的(β/α)₈三維結構，兩個谷氨酸催化殘基分別位于第4和第7個β折疊的羰基端（Henrissat?B,Davies?G.Structural?and?sequence-based?classification?of?glycoside?hydrolases.Curr?Opin?Struct?Biol.1997,7(5):637-644.）。報道的11家族的木聚糖酶具有很多優良的性質，例如分子量小（～20kDa）、高表達量、高催化效率和比活力、各種pH值和最適溫度，使它們適用于多種工業需求（G,Berrin?JG,Beaugrand?J.GH11?xylanases:Structure/function/properties?relationships?and?applications.Biotechnol?Adv.2012,30(3):564-592.）。目前，已經從微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚糖酶，并克隆得到其木聚糖酶基因在畢赤酵母進行了異源高效表達，并已工業化生產。在飼料行業中的應用，木聚糖酶可以有效破壞木聚糖分子中的共價交聯，降低食糜的粘度，改善飼料性能，降低因粘度增加而引起的抗營養作用。在啤酒釀造行業降解阿拉伯木聚糖，提高了流速，降低了粘度，增加了啤酒的生產成本和品質。

本發明中，我們從Penicillium?sp.C1中克隆得到11家族木聚糖酶基因xyn11C1，并在畢赤酵母進行了異源表達，發現其分泌量中形式的酶蛋白，其中發生N-糖基化酶的對可溶性小麥阿拉伯木聚糖比活為7943U/mg，是非糖基化的2.8倍，而兩者其他性質都相似。N-糖基化酶具有高催化效率，高比活，能更有效的降解木聚糖底物，使生產成本降低。因此，N-糖基化木聚糖酶的產生、純化、性質、結構特征的結構基礎及其在飼料加工、釀酒工業、果汁加工、以及能源等領域的應用正在不斷深入。

由于不同工業對木聚糖酶性質需求不同，因此，獲得新型具有高催化特性的木聚糖酶的研究仍具有重大意義。克隆和分離具有N-糖基化的木聚糖酶可以更好的應用于飼料、釀酒，食品工業。

發明內容

本發明的目的是提供一種能高效應用的N-糖基化木聚糖酶。

本發明的再一目的是提供編碼上述N-糖基化木聚糖酶的基因。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。