[發明專利]一種蛋白質樣品原位快速預處理方法

有效

• 申請號: 201310105940.2
• 申請日: 2013-03-29
• 公開（公告）號: CN104075931A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 張麗華;方菲;趙群;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/44
• 分類號: G01N1/44;G01N1/34
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及一種蛋白質樣品原位快速預處理方法。

背景技術

蛋白質的鑒定與社會人群的健康息息相關。對于大部分遺傳疾病，如腫瘤和肥胖癥，患者與健康人群的某些特定蛋白存在差異性表達。為實現疾病的“早發現，早治療”，對特定蛋白質的快速及高靈敏度的鑒定具有重要意義。作為蛋白質分析的首要步驟，蛋白質樣品預處理可實現雜質的去除及樣品的富集，因此建立高效快捷的蛋白質樣品預處理方法，在實現高靈敏度、高準確度的差異性蛋白質的研究過程中發揮重要作用，進而推動疾病的發現與治療上的深入研究。

目前，基于凝膠的樣品預處理和基于自由溶液的樣品預處理是蛋白質組常用的兩大技術。然而，膠上酶解耗時長，后續處理復雜，且樣品損失嚴重。此外，酶解效率與肽段的提取效率有待提高；自由溶液酶解具有酶解時間長（通常需要10h以上）的缺點，無法滿足快速處理的要求。近些年來發展的酶反應器具有酶解時間短，酶解效率高，可與多維分離平臺聯用，實現自動化等優點。然而，酶反應器基質材料的非特異性吸附問題會造成酶解重現性差，不利于樣品的分析。（Liang,Y;Tao,D.Y.;Ma,J.F.;Sun,L.L.;Liang,Z.;Zhang,L.H.;Zhang,Y.K.J.Chromatogr.A2011,1218(20),2898-2905）

近年來大量有關超濾膜的實驗結果表明，超濾膜的使用具有很好的去噪效果、樣品損失量較小、易實現溶劑置換的優勢。同時，微波輔助由于其高效性早已被用于樣品預處理過程中。本發明結合了超濾膜的去噪性能和微波水浴輔助酶解的高效性，并提出了樣品在膜上原位進行樣品預處理所有步驟，進一步減少樣品的損失量，從而發展出一種新型樣品預處理方法，具有高效、快速、回收率高的優點。

發明內容

為了克服蛋白質樣品預處理過程耗時長，操作繁瑣，損失量大等不足，本發明提供一種蛋白質樣品原位快速預處理方法，于離心超濾裝置中集成了蛋白質的變性、還原、溶劑置換、烷基化、酶解及雜質去除整個樣品預處理過程。同時，采用微波水浴輔助酶解，可有效降低酶解時間，提高酶解效率。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

（1）蛋白質樣品的原位富集：采用pH為1-6.5的酸性溶液或pH為7.5-14的溶有體積濃度為1%-30%的表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、TritonX-100、chaps、Rapigest?SF或NP-40d）或去垢劑（尿素、硫脲或鹽酸胍）的堿性溶液溶解蛋白質樣品，將蛋白質樣品溶液加入至超濾管中實現蛋白質的原位富集；

（2）溶劑的置換：蛋白質樣品溶液經步驟（1）處理后，若蛋白質樣品后續還原過程所需溶液體系環境與蛋白質樣品溶解液體系環境所需酸堿環境不同，則需進行pH置換，即若蛋白質溶解液體系為pH為1-6.5的酸性溶液（甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液），而后續還原過程所需溶液體系為堿性環境，則在蛋白質原位富集后將離心超濾裝置離心，待超濾管內溶劑全部離心至收集管后，向超濾管中加入體積為1-20倍蛋白質溶解液體積的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液（碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液）；若蛋白質溶解液體系為pH為7.5-14的堿性緩沖溶液，而后續還原過程所需溶液體系為酸性環境，則在蛋白質原位富集后將離心超濾裝置離心，待超濾管內溶劑全部離心至收集管后，向超濾管中加入體積為1-20倍蛋白質溶解液體積的pH為1-6.5的酸性溶液；若后續蛋白質樣品還原過程所需溶液體系環境與蛋白質樣品溶解液體系環境所需酸堿環境相同，則不需要進行pH置換；

（3）蛋白質樣品的變性及還原：向步驟（2）中處理的樣品溶液中加入還原劑（二硫蘇糖醇（DTT）、磷酸三氯乙酯（TCEP）或β-巰基乙醇），在高溫水浴下，同時進行蛋白質樣品的變性及還原過程；

（4）雜質的去除：將步驟（3）中處理的樣品溶液經離心后，向超濾管中加入體積為蛋白質樣品還原體系溶液體積的1-20倍的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液（碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液、或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液）或水溶液并離心，去除蛋白質溶液中的小分子雜質；

（5）蛋白質樣品的烷基化及酶解：向步驟（4）中離心后的超濾管中加入以pH為7.5-9的堿性緩沖溶液為溶劑配制的烷基化溶液（碘代乙酸或碘乙酰胺）及胰蛋白酶溶液后，將樣品轉入至盛有水的微波盒，并將微波盒轉入至微波爐中，采用微波水浴輔助方法同時進行烷基化及酶解過程；