[發明專利]一種用于CHO細胞表達可溶性重組人透明質酸酶PH20的基因序列有效

申請號：	201310102467.2	申請日：	2013-03-27
公開（公告）號：	CN103173474A	公開（公告）日：	2013-06-26
發明（設計）人：	李潤明;丘力功;黃明;陳建農;韋劍;蔡小杰;孫希海	申請（專利權）人：	廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司
主分類號：	C12N15/56	分類號：	C12N15/56;C12N15/63;C12N15/85;C12N5/10;C12N9/26
代理公司：	廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205	代理人：	張海文
地址：	511495 廣***	國省代碼：	廣東;44
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	一種用于 cho 細胞表達可溶性重組透明質酸酶 ph20 基因序列
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）重組表達可溶性透明質酸酶的基因序列和含有該基因的工程細胞株。

背景技術

透明質酸酶是降解透明質酸的酶家族，透明質酸是胞外基質的必需組分以及間質屏障的主要成分。透明質酸酶能使透明質酸產生低分子化作用，從而降低透明質酸的活性和粘度，提高組織中液體滲透能力。

透明質酸酶家族包括細菌透明質酸酶，來自寄生蟲和甲殼動物的透明質酸酶和來自哺乳動物的透明質酸酶。而人的基因組中有6個類透明質酸酶基因：HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。其中，HYAL3、HYAL4呈現出沒有或很少的降解透明質酸活性，而HYAL1、HYAL2是酸活性透明質酸酶，在中性pH條件下一般缺乏催化活性，PH20是中性活性酶，在人體的血液或組織液的pH范圍內具有催化活性。

透明質酸酶主要用來改善其他注射用藥物的滲透和增加其他藥物的組織滲透性和促進擴散或分散。最常見的應用是眼科手術和局部麻醉藥物的快速滲透（如牙科），小兒靜脈點滴中無法找到血管時使用。還可用于治療腫瘤，與昂貴的抗體配合皮下注射代替靜脈點滴，保持胰島素和其它泵給藥的通暢等用途。由于來源于動物組織中提取的透明質酸酶免疫原性較強，不適于運用于人體臨床，利用基因工程重組技術表達、生產人透明質酸酶已成為必然的趨勢。由于人全長PH20氨基酸序列的?C端含有糖基磷脂酰肌醇（GPI）修飾位點，影響了其向宿主細胞外的可溶性分泌，故構建可溶性PH20分泌表達株時要去掉PH20前體蛋白（precursor）氨基酸序列C端對應的編碼序列，而留下PH20?前體蛋白中1-482位氨基酸對應的編碼序列。表達的蛋白稱為可溶性重組人PH20蛋白（soluble?rHuPH20）。如美國FDA批準上市的Hylenex透明質酸酶，即是soluble?rHuPH20?。

中國倉鼠卵巢細胞（Chinese?hamster?ovary?cell，CHO）是一種來源于中國倉鼠卵巢的纖維母細胞，是哺乳動物表達系統常用的宿主細胞。它具有很多優點：準確的轉錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然蛋白分子，表達產物細胞外分泌，便于分離純化，而且由于其屬于成纖維細胞，很少分泌內源蛋白，利用外源蛋白的分離純化。

????我們在研究中發現，用含可溶性rHuPH20天然基因序列的載體轉染遺傳工程改造的CHO細胞株（具體為DG44細胞株）而構建的工程細胞株表達PH20的水平較低，導致生產成本高昂。我們對天然序列優化后的基因序列能大大提高目的蛋白在CHO細胞株中的表達水平。

發明內容

本發明的目的在于：針對編碼可溶性rHuPH20的天然基因低表達的缺陷，通過優化基因序列，實現可溶性rHuPH20在CHO工程細胞株中的高表達。

本發明所采取的技術方案是：

優化的人透明質酸酶PH20的基因序列，其具有SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

在上述人透明質酸酶PH20優化基因序列5’端添加kozak共有序列，得到其衍生的DNA序列

一種克隆載體，含有上述人透明質酸酶PH20優化基因序列或者由其衍生DNA序列。

一種表達載體，含有上述人透明質酸酶PH20優化基因序列或者由其衍生DNA序列。

所述表達載體的起始載體為哺乳動物細胞表達載體。

一種中國倉鼠卵巢細胞表達株，含有上述的表達載體。

所述的中國倉鼠卵巢細胞表達株為DHFR基因缺陷型。

上述中國倉鼠卵巢細胞表達株在生產可溶性重組人透明質酸酶PH20上的應用。