[發(fā)明專利]一種用于尿酸誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的DNA片段及相關(guān)啟動(dòng)子與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310101960.2
• 申請(qǐng)日: 2013-03-27
• 公開（公告）號(hào): CN104073489A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁朝寧;熊丹丹;唐雙焱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/31;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C12N15/70;G01N33/68;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于尿酸誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的DNA片段及相關(guān)啟動(dòng)子與應(yīng)用。

背景技術(shù)

重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要研究內(nèi)容，已在食品、制藥、洗滌劑生產(chǎn)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。其中，細(xì)菌異源表達(dá)系統(tǒng)具有細(xì)菌生長代時(shí)短、菌體生長密度高、底物廉價(jià)、遺傳背景清楚、適合進(jìn)行工程菌株改造等顯著優(yōu)勢(shì)，尤其是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，已成為應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一。

異源蛋白的重組表達(dá)，通常要求通過分子克隆等技術(shù)將目標(biāo)蛋白編碼序列置于具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄能力啟動(dòng)子之后。目前，已有多種大腸桿菌適用的啟動(dòng)子被研究報(bào)道。其中直接或間接受異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷調(diào)控的lac、tac、trc、T7啟動(dòng)子，受四環(huán)素調(diào)控的tet啟動(dòng)子，受阿拉伯糖調(diào)控的阿拉伯糖啟動(dòng)子（P_BAD），受鼠李糖調(diào)控的rha?P_BAD等已被應(yīng)用，成功表達(dá)了多種不同類型的異源重組蛋白。

大腸桿菌的乳糖操縱子已被深入研究。乳糖啟動(dòng)子lac本身轉(zhuǎn)錄能力較弱，不適用于重組蛋白的大量表達(dá)。但許多啟動(dòng)子的構(gòu)建，都是在乳糖操縱系統(tǒng)的功能元件上改造而成。例如，經(jīng)典的tac啟動(dòng)子和trc啟動(dòng)子均由色氨酸啟動(dòng)子的-35區(qū)和lac啟動(dòng)子的-10區(qū)組合拼接而成，較之lac啟動(dòng)子具有更高的表達(dá)效率。而T7啟動(dòng)子則利用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷來調(diào)控T7RNA聚合酶的表達(dá)，進(jìn)而開啟T7啟動(dòng)子系統(tǒng)表達(dá)下游重組蛋白；這一技術(shù)已被Novagen等公司研發(fā)出系列商業(yè)化載體，成功表達(dá)了多種不同來源的異源蛋白。

總結(jié)一下，一套成功的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，首先要求啟動(dòng)子的相關(guān)元件能被宿主菌識(shí)別。而要成功表達(dá)異源重組蛋白，不僅要求啟動(dòng)子具有較高的轉(zhuǎn)錄效率，還要求啟動(dòng)子滲漏性表達(dá)水平較低，尤其是一些對(duì)宿主細(xì)胞具有一定毒性的蛋白。最后，從降低生產(chǎn)成本考慮，誘導(dǎo)物本身價(jià)格應(yīng)較為低廉，來源廣泛，且不被宿主菌本身代謝系統(tǒng)所降解利用。

具強(qiáng)耐輻射特性的極端微生物耐輻射球菌（Deinococcus?radiodurans）的基因組分析揭示了該菌抗逆特性相關(guān)的部分功能組件。其中，編碼區(qū)dr1159編碼的推測尿酸酶調(diào)控蛋白（hypothetical?uricase?regulator，HucR）的研究顯示，HucR可形成蛋白二聚體結(jié)合于其自身編碼序列和反向的尿酸酶編碼序列的啟動(dòng)子區(qū)域（hucO）中的DNA結(jié)合位點(diǎn)序列；但與尿酸結(jié)合后，HucR蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從DNA結(jié)合位點(diǎn)解離；因此，HucR調(diào)控系統(tǒng)成為耐輻射球菌根據(jù)環(huán)境尿酸情況變化，有效調(diào)控HucR蛋白本身及尿酸降解相關(guān)的尿酸酶表達(dá)的系統(tǒng)。因?yàn)槟蛩崾且环N價(jià)格較低廉的化合物，并且不為大腸桿菌所代謝利用，此研究結(jié)果預(yù)示著可對(duì)此啟動(dòng)子加以改造，構(gòu)建以尿酸為誘導(dǎo)物的大腸桿菌重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA分子。

本發(fā)明提供的DNA分子，其核酸序列為序列表中序列1自5’末端第143-200位核苷酸。

上述DNA分子作為啟動(dòng)子中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

含有上述DNA分子的DNA片段也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述DNA片段由DNA片段1、目的蛋白基因和含有上述DNA分子的DNA片段2組成；

所述DNA片段1為含有驅(qū)動(dòng)HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達(dá)的啟動(dòng)子CP6、HucR編碼基因、YgfU編碼基因的片段；

上述DNA分子用于驅(qū)動(dòng)所述目的蛋白基因表達(dá)。

上述HucR編碼基因和YgfU編碼基因的轉(zhuǎn)錄方向與目的蛋白基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。

在上述DNA片段中，所述驅(qū)動(dòng)HucR編碼基因和YgfU編碼基因表達(dá)的啟動(dòng)子CP6的編碼序列為序列1自5’末端第3244-3303核苷酸的反向互補(bǔ)序列；

所述HucR編碼基因的編碼序列為序列1自5’末端第2662-3224核苷酸的反向互補(bǔ)序列；

所述YgfU編碼基因的編碼序列為序列1自5’末端第1197-2645位核苷酸的反向互補(bǔ)序列；

所述DNA片段1具體為序列表中序列1自5’末端958-3303位核苷酸的所示的雙鏈DNA分子；

所述DNA片段2具體為序列表中序列1自5’末端143-279位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。