[發明專利]RAPD-PCR試劑盒、擴增方法及其應用

有效

• 申請號: 201310101897.2
• 申請日: 2013-03-27
• 公開（公告）號: CN103146687A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 李元實;馬林;羅昭標;樸永革;金哲;崔成哲;于海順
• 申請（專利權）人: 吉林煙草工業有限責任公司;鄭州輕工業學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵;李玉秋

1.一種RAPD-PCR試劑盒，其特征在于，包括Mg²⁺1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、隨機引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。

2.根據權利要求1所述的試劑盒在擴增成品卷煙煙絲總DNA中的應用。

3.一種成品卷煙中煙絲總DNA的擴增方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：獲得成品卷煙煙絲總DNA；

步驟2：取所述成品卷煙煙絲總DNA經第一RAPD-PCR，獲得第一擴增擴產物；

步驟3：取所述第一擴增產物稀釋后經第二RAPD-PCR，獲得第二擴增產物；

所述第一RAPD-PCR的反應體系為所述成品卷煙煙絲總DNA5ng～80ng、Mg²⁺1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、隨機引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U；

所述第二RAPD-PCR的反應體系為所述第一擴增產物5ng～80ng、Mg²⁺1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、隨機引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。

4.根據權利要求3所述的擴增方法，其特征在于，所述第一RAPD-PCR或第二RAPD-PCR的擴增程序包括：

預變性94～95℃，5～7min；

變性94～95℃，45～65s；

退火37～40℃，30～40s；

延伸72℃，90～100s；

終延伸72℃，5～6min；

30～40個循環。

5.根據權利要求3所述的擴增方法，其特征在于，所述步驟2與所述步驟3之間還包括取所述第一擴增擴產物經第一電泳的步驟。

6.根據權利要求5所述的擴增方法，其特征在于，所述第一電泳采用的瓊脂糖凝膠的濃度為2～3%。

7.根據權利要求3所述的擴增方法，其特征在于，步驟3中所述稀釋的倍數為10～50倍。

8.根據權利要求3所述的擴增方法，其特征在于，所述第二RAPD-PCR后還包括取所述第二擴增擴產物經第二電泳的步驟。

9.根據權利要求8所述的擴增方法，其特征在于，所述第二電泳采用的瓊脂糖凝膠的濃度為2～3%。