[發明專利]一種快速分離純化及富集派琴蟲的方法

有效

• 申請號: 201310100222.6
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103235118A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 鄧俊花;吳紹強;林祥梅;馮春燕;王彩霞
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N1/34;G01N1/40;G01N33/577
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.一種派琴蟲免疫磁珠的制備方法，其特征在于，所述方法為將派琴蟲單克隆抗體與磁珠共價結合，通過包被和洗滌獲得派琴蟲免疫磁珠。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）取5mg?Dynabeads?M-270beads于1.5mL的新離心管中，加入1mL?C1懸浮磁珠；

（2）磁力收集磁珠，棄上清；在離心管中加入(250-V₀)μL?C1懸浮磁珠，待用；

（3）在磁珠懸液中加入V₀μL派琴蟲細胞壁特異性單克隆抗體，混勻；再加入250μL?C2，混勻；

（4）將懸液在37℃，1000rpm下孵育20～25h；

（5）孵育完畢，磁力收集磁珠，棄上清，分別用HB、LB及SB各洗滌1次，SB再重復洗滌磁珠1次，洗滌完畢后收集磁珠，在磁珠中加入800μLSB，室溫，1000rpm下吸附15min；

（6）吸附完畢，用500μL?SB重懸磁珠，此溶液即為派琴蟲免疫磁珠溶液。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3）中在磁珠懸液中加入30μL派琴蟲細胞壁特異性單克隆抗體，所述抗體濃度為1.5mg/mL。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（6）中派琴蟲免疫磁珠溶液的終濃度為9μg?McAb/mg?beads。

5.一種分離純化及富集派琴蟲的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）權利要求1～4任一項所述方法制備派琴蟲免疫磁珠；

（2）分離純化派琴蟲：所述派琴蟲免疫磁珠與派琴蟲進行特異吸附；將派琴蟲與派琴蟲樣品中其它物質分離，獲取純化的派琴蟲抗原抗體復合物與磁珠的結合物；

（3）熒光顯微鑒定：派琴蟲抗原抗體復合物與磁珠的結合物通過吖啶橙染色，熒光顯微鏡檢，觀察分離效果；

（4）富集派琴蟲：當呈陽性反應時，將派琴蟲抗原抗體復合物與磁珠的結合物在低鹽低pH環境下分離磁珠與派琴蟲抗原抗體復合物，獲取富集后的派琴蟲。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（2）包括如下步驟：

（A1）制備好的免疫磁珠用pH為7.4的PBS洗滌一次后恢復原體積，備用；

（A2）取派琴蟲懸液200μL，4000rpm離心5min，離心后棄上清，用pH為7.4的PBS洗滌一次，再加入200μL?PBS溶解；

（A3）取20μL（A1）中的免疫磁珠溶液，磁力收集磁珠后加入（A2）中的派琴蟲懸液200μL，混勻，在37℃，1000rpm下結合反應10～60min；

（A4）磁力收集磁珠，并用pH為7.4的PBS洗滌磁珠2次，洗滌完畢后，加入20μLpH為7.4的PBS重懸磁珠。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(A2)中，派琴蟲懸液為派琴蟲培養液時，所述方法檢測派琴蟲培養液的最低檢測限為10²個/mL；派琴蟲懸液為派琴蟲陽性模擬液時，所述方法檢測派琴蟲陽性模擬液的最低檢測限為10³個/mL。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（A3）中免疫磁珠捕獲派琴蟲的時間為30min。

9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（4）包括如下步驟：

（A1）當呈陽性反應時，將含派琴蟲抗原抗體復合物與磁珠的結合物溶液磁力收集磁珠，加入100μL0.1M?pH為3.1的檸檬酸鹽溶液，混勻，室溫放置5min，分離beads與派琴蟲；

（A2）磁力收集磁珠，將含有派琴蟲的上清在4000rpm下離心5min，獲得富集的派琴蟲。

10.權利要求5～9任一項所述方法在貝類樣品派琴蟲檢測領域的應用。