[發(fā)明專利]一種提取血液中低豐度病毒核酸的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310099870.4
• 申請(qǐng)日: 2013-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN104073484A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃泓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海碩美生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到使用納米磁珠從血液中提取低豐度病毒核酸，包括單鏈和雙鏈DNA，RNA。

背景技術(shù)

核酸提取與純化技術(shù)是生物化學(xué)與分子生物學(xué)的一項(xiàng)基本技術(shù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)哉，核酸的提取與純化技術(shù)也得到進(jìn)一步發(fā)展。

核酸在細(xì)胞中與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。核酸的提取主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分離。大多數(shù)核酸的提取步驟，一般都包括細(xì)胞裂解、去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及多糖、脂類等生物大分，去除其它不需要的核酸分子，去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等步驟。

常用的核酸純化方法有(1)酚抽提/沉淀法：將細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)混合液，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻后離心分離，再將核酸用有機(jī)溶劑沉淀，通過沉淀濃縮核酸，改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。(2)硅膠膜柱法：在一定的離子環(huán)境下，核酸可被選擇性地吸附到纖維膜的硅膠基團(tuán)上，而與其他生物分子分離；

基于納米磁珠的核酸純化技術(shù)是利用親水性納米磁珠吸附樣品的核酸分子，在外加磁場作用下將負(fù)載核酸的納米磁珠從樣品溶液中分離出來，經(jīng)適當(dāng)洗滌后，加入適當(dāng)?shù)娜芤菏购怂釓募{米磁珠上脫附即得到純化后的核酸。

納米磁珠在核酸純化中易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，無需進(jìn)行乙醇沉淀、苯酚/氯仿萃取、離心和柱層析處理，從而避免連續(xù)重復(fù)的手工抽取，不僅減少了樣品損失與污染，還大大地提高了樣品處理的通量，成為目前分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的理想的輔助工具。

由于普通的納米磁珠表面包被了一層硅酸鹽材料，在核酸提取純化過程中能夠吸附所有的核酸，洗脫后得到的是多種核酸的混合物，會(huì)對(duì)后面的PCR擴(kuò)增以及其他樣本的處理造成干擾，也可能降低某些低豐度核酸序列的得率和產(chǎn)量，對(duì)于要求高靈敏度的臨床檢測，會(huì)造成檢測結(jié)果的假陰性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于提取特異序列核酸的方法，以提高某些低豐度核酸序列的得率和產(chǎn)量(如病毒核酸的提取)，以滿足臨床檢測對(duì)核酸樣品提取的要求，如血液篩查中對(duì)HBV病毒DNA提取的要求。

本發(fā)明的特異性核酸提取方法，其特征包括以下步驟：

(1)加入裂解液將血液中的病毒核酸釋放到溶液中。

(2)加入標(biāo)記有生物素的特異性核酸片段，與釋放到溶液中的病毒核酸進(jìn)行核酸雜交。

(3)加入標(biāo)記有鏈霉親和素的納米磁珠，并與溶液中的生物素給合，形成磁珠-鏈霉親和素-生物素-特異性核酸片段-病毒核酸的復(fù)合體。

(4)用洗滌液洗滌磁珠

(5)用洗脫液將病毒核酸從磁珠復(fù)合體上洗脫下來。上述標(biāo)記有鏈親和素的納米磁珠為商品化產(chǎn)品。

本發(fā)明使用的納米磁珠是一種均一、超順磁性的微球體，在其表面共價(jià)結(jié)合有鏈霉親和素(streptavidin，SA)。鏈霉親和素是一種由四個(gè)相同的亞基組成的蛋白質(zhì)，能高度特異性地與四分子生物素(biotin)結(jié)合，兩者之間的親和力極為強(qiáng)烈，其解離常數(shù)Kd為10-15M。這種鏈霉親合素與生物之間的高親和力可以快速、高效地分離生物素標(biāo)記的靶分子。生物素-鏈霉親合素的相互作穩(wěn)定，對(duì)DNA分子進(jìn)行諸如解鏈、洗脫、雜交等操作不影響DNA在納米磁珠表面的穩(wěn)定性。

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中HBV等病毒序列數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)核酸序列，使其能與HBV的所有亞型結(jié)合。將此序列進(jìn)行生物素標(biāo)記。DNA病毒和RNA病毒經(jīng)過裂解液同時(shí)裂解，核酸游離在溶液中，加入生物素標(biāo)記的特異性序列，與病毒DNA或RNA互補(bǔ)結(jié)合，然后再與標(biāo)記有鏈霉親合素的磁珠相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)磁珠對(duì)特定病毒DNA或RNA的捕獲，經(jīng)過洗滌和洗脫等步驟后，獲得病毒DNA和RNA。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明采用特異性核酸提取方法，使用鏈霉親和素和生物素高親和力系統(tǒng)有效的提高了低滴度病毒樣品中核酸得率和產(chǎn)量，從而有效的減少因核酸提取效率低而導(dǎo)致臨床檢測結(jié)果的假陰性。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，

1)購買含有鏈霉親和素的納米磁珠。

2)合成HBV病毒特異核酸序列

5’-[biotion]TGCTGCTGCCTCATCCTTGTC-3’

3)用移液器在2ml離心管內(nèi)加入0.9ml混合血液樣本和0.9ml裂解液，用振蕩器混勻后，加入10ul?HBV特異核酸序列，75℃加熱10分鐘，再室溫冷卻10分鐘。

4)加入20ul磁珠溶液，室溫混勻10分鐘，使得樣本中的生物素與磁珠上的鏈霉親和素充分結(jié)合。