[發明專利]高免疫原性狂犬病毒固定株的選育及其在疫苗開發中的應用

有效

• 申請號: 201310099700.6
• 申請日: 2013-03-27
• 公開（公告）號: CN103146655A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 艾文;沈名鋒;劉鈿蓮
• 申請（專利權）人: 廣州銀河陽光生物制品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/205;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 李永慶

技術領域

本發明涉及一種狂犬病毒固定株的選育方法及其應用，具體涉及一種高免疫原性狂犬病毒固定株的選育及其在狂犬病疫苗開發中的應用。?

背景技術

狂犬病是一種嚴重的致死性流行病。感染狂犬病毒后一旦出現臨床癥狀，存活的預后極差，死亡幾乎不可避免。目前全球超過25億人生活在狂犬病流行區而受到該疾病的威脅，每年導致5萬多人死亡，其中半數以上是年齡小于15歲的兒童，他們是感染狂犬病的高危人群。中國也是狂犬病流行高發區，狂犬病死亡率長期居于中國各類法定傳染病首位。?

由于沒有任何針對狂犬病的有效治療藥物能夠成功得到應用，研發狂犬病疫苗（包括人用疫苗和動物用疫苗）成為控制疾病危害的唯一有效手段。?

人用狂犬病疫苗的研發歷史已超過百年。鑒于狂犬病的超高致死率，疫苗品種更新換代的需求比其他流行病疫苗更為迫切，研發更為安全有效的新一代人用狂犬病疫苗成為疫苗開發的熱點。國內外研發了種類繁多的人用狂犬病疫苗新品種，包括全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗等。在這些不同類型人用狂犬病疫苗研發品種中，全病毒滅活疫苗的保護效果是最好的，也是目前唯一得到臨床應用的人用狂犬病疫苗。預計在未來相當長的一段時期，人用狂犬病疫苗的更新換代，依然將以全病毒滅活疫苗技術路線為重點。其中，Vero細胞疫苗以其安全性好、成本低以及適應于工業化生產等優勢，成為國內外人用狂犬病疫苗研發的主流。?

現有的人用狂犬病疫苗存在免疫失敗的問題，Vero細胞疫苗也不例外，尤其是針對嚴重暴露于狂犬病毒的人群，免疫失敗比例較高。導致免疫失敗的重要原因之一是疫苗生產用毒種免疫原性不夠高。對于嚴重暴露于狂犬病毒的人群，如果疫苗生產用毒種免疫原性偏低，普通的抗原劑量就不足以保證疫苗的免疫保護效果，而進一步提高抗原劑量又可能導至免疫人群出現嚴重的不良免疫反應。通過提高疫苗生產用毒種的免疫原性，就有可能在不增加抗原劑量、保證安全性的前提下大幅度提高疫苗對所有免疫人群的保護效果。因此，高免疫原性疫苗生產用毒種的選育對人用狂犬病疫苗更新換代、進一步提高疫苗免疫保護效果、降低狂犬病的發病率和死亡率具有重要意義。?

發明內容

本發明的目的是提供一種高免疫原性狂犬病毒固定株的選育方法，尤其是能用Vero細胞進行大規模、高產率培養的高免疫原性狂犬病毒固定株的選育方法。?

本發明的另一目的是提供新的狂犬病毒固定株。具體涉及所述的狂犬病毒固定株，能以Vero細胞作培養基質高滴度培養；與國內外現有的狂犬病毒固定株相比，免疫原性更高；病毒基因組堿基序列及病毒蛋白質氨基酸序列與國內外現有的狂犬病毒固定株不同，且這些基因組堿基序列的差異和蛋白氨基酸序列的差異能穩定遺傳，在以Vero細胞進行連續傳代過程中至少15代以內保持不變。?

本發明還提供了以此選育方法得到的狂犬病毒固定株在開發人用或動物用疫苗中的應用。?

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：?

（1）????鼠腦毒種的擴增和純化

從國內外被普遍認可的病毒保藏機構取回aG株或其他經動物腦組織傳代建株的狂犬病毒固定株，病毒接種20-25日齡豚鼠腦腔，豚鼠出現典型狂犬病癥狀時無菌條件下取腦，加入維持液A（含0.5%牛白蛋白的M199培養基，PH7.0—8.0）后研磨腦組織制成勻漿，高速離心除去沉淀，上清液經蔗糖密度梯度超速離心3-5小時，收取蔗糖濃度為45%-55%的組份，透析去除蔗糖，稀釋制成滴度為9.0-10.0LogLD50/ml病毒懸液；

（2）鼠腦病毒對Vero細胞的適應培養