[發明專利]一種黃曲霉尿酸氧化酶在巴斯德畢赤酵母中的高效表達與純化的方法

無效

• 申請號: 201310098371.3
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103160522A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 胡征;楊波;劉志剛
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/81;C12N9/06
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種黃曲霉尿酸氧化酶在巴斯德畢赤酵母菌中的高效表達的方法，還涉及一種黃曲霉尿酸氧化酶的純化方法。

背景技術

尿酸（又稱2，6，8--三氧嘌呤）是人體內嘌呤內化合物代謝的最終產物，血尿酸水平取決于尿酸產生和排泄的動態平衡，而血漿尿酸的飽和度：37℃，PH7.4時為380～420μmol/L(6.4～7.1mg/dL)。

尿酸大多經肝尿酸鹽氧化酶(尿酸酶)分解形成尿囊素由尿中排出，人類尿酸為內源性嘌呤，經黃嘌呤氧化酶在肝、腸作用形成最終降解產物。外源性嘌呤亦為尿酸重要來源。國內資料顯示，男性平均為5.7㎎/dL，女性4.3mg/dL，其中2/3經尿排除。影響尿酸水平的因素很多，如嘌呤代謝和尿酸合成的酶活性，腎臟濾過及主動轉運功能，藥物(如長期服用利尿劑)，飲食結構(如酗酒、嘌呤類物質攝入過多)及全身性疾病(如高血壓病、全身紫紺性心臟病、慢性阻塞性肺氣腫)。

升高的血尿酸在關節中形成尿酸鈉水合物的微結晶，會引起痛風性急性關節炎的反復發作，關節、骨骼、軟組織的痛風石沉積、痛風石性慢性關節炎和關節畸形，常累積腎臟引起慢性間質性腎炎和尿酸腎結石形成。有資料顯示我國20歲以上的人群高尿酸血癥的發病率為2.4-5.7%，且有10%會發展成為痛風。

如果血清中的尿酸的濃度高于正常值，就導致高尿酸血癥（Hyperuricemia）。高尿酸易在關節中形成尿酸鈉水合物的微結晶，會引起痛風性急性關節炎。另外惡性腫瘤的增殖會加快核酸分解代謝，嘌呤代謝產生生大量的尿酸會導致會出現該癥狀出現。腫瘤放射化療過程也因為細胞的大量裂解而出現伴隨高尿酸血癥的腫瘤消退綜合癥（tumor?lysissyndrome,TL?S）。TLS會增加胞內物質如鉀、磷、鈣、尿酸等的濃度，大大超過了人體腎臟的排泄能力，導致高尿酸、高鉀、高磷、高鈣、高尿酸等癥，最后導致腎臟衰竭。我國每年新發的癌癥病人約為170萬，大部分在發病以后采用化療和放療等治療手段，而化療和放療時細胞分裂過剩和急劇破壞，核酸分解突然增多產生大量尿酸，導致尿酸血癥，引起結石和腎衰，給病人帶來生理和心理上極大的痛苦。

目前控制TLS的有飲食控制、水合、堿化酸毒癥，用別嘌呤醇和尿酸氧化酶利尿等手段，但別嘌呤醇是靠抑制黃嘌呤氧化酶的活性從而阻礙黃嘌呤和次黃嘌呤轉化為尿酸，干擾6-巰基嘌呤的代謝，影響腫瘤的代謝，而且由于黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化受阻，相應的增加了腎臟的負荷，黃嘌呤比尿酸更難容與尿中。用別嘌呤醇治療的病人可能會出現黃嘌呤腎病和結石。另外，別嘌呤醇對病人體內存留尿酸的排泄沒有作用，而且有2%的病人再用別嘌呤醇的治療過程中會產生過敏反應，甚至出現嚴重的超敏反應綜合癥，對于急性高尿酸血癥的病人，別嘌呤醇也不能起到及時的治療效果。

尿酸氧化酶（尿酸氧酶，Urate?Oxidase,Uricase）普遍存在與自然界，在大多數動物體內該酶參與嘌呤代謝，將尿酸氧化為尿囊素。尿囊素是一種比較容易排泄的代謝物，其溶解度為尿酸的5-10倍，但在人和一些長靈類體內缺乏這種酶而尿酸作為最終產物而排出體外。1943年，Oppenheimer首次通過實驗發現注射尿酸氧化酶可以降低血尿酸水平。1957年，動物來源的尿酸氧化酶用于臨床治療獲得了一定的成功。1974年（Current?Rheumatol?ogy?Reports2001,3:29-35）從微生物Aspergillus?flavus中提取了尿酸氧化酶治療痛風，而且這種直接提取的天然尿酸氧化酶也在歐洲上市已有20年，通過注射給藥用于白血病化療的嚴重高尿酸血癥。但從微生物Aspergillus?flavus中直接提取酶周期長，發酵過程難于控制，易受病原體污染，產率低，產品純度不高，在使用中產生還會產生副作用。1992年有人用基因重組的大腸桿菌來嘗試對黃曲霉尿酸氧化酶基因進行胞內表達（J.Biol.Chem.1992,267(12):8565-8570），有酶活性，但表達量低，無產業化前景。近幾年釀酒酵母表達的基因重組的Aspergillus?flavus尿酸氧化酶(Leplatois?P.et?al.,Gene.,1992,122,139-145)先后在歐洲和美國上市（商品名Fasturtec），用于高尿酸血癥的預防和治療（腫瘤化療高尿酸血癥的治療和預防），但該方法表達的重組尿酸氧化酶以可溶解的活性形式畜積在胞內空隙中,這增加了提純到藥用級的難度；并且利用釀酒酵母作為宿主菌，會出現糖基化修飾過度的問題，這也增加了蛋白后處理的難度。