[發明專利]一種基于順磁納米Fe-Ni-Co合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法

有效

• 申請號: 201310097671.X
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103217450A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 張錦勝;唐群;賴衛華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08;G01N33/577
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及一種致病菌的快速檢測方，尤其涉及一種基于順磁納米Fe-Ni-Co合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法。

背景技術

基本原理：單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結合。Fe-Ni-Co合金材料具有鐵磁性，當粒子直徑小到一定程度會出現順磁特性。即沒有外加磁場時沒有磁性，而在有外加磁場時表現出一定的磁性，可以用于磁分離。同時，順磁性物質對核磁共振信號的影響十分顯著，微量的順磁性物質就會使核磁共振信號表現出變化。因此可以構建順磁性的特異性Fe-Ni-Co合金納米探針生物傳感器，從磁共振的角度來做檢測。

其主要的原理步驟：1.?在樣品中加入檢測目標菌的第1抗體，若樣品中存在目標菌，則通過抗體抗原的結合形成1抗復合物，此時1抗起信號放大作用。2.?從市場上購買順磁納米Fe-Ni-Co合金材料，也可以通過其他方法制備納米級的Fe-Ni-Co合金。使用硅烷偶聯劑，其通式為:Y(CH₂)nSiX₃。此處，n為0-3；X為可水解的基團；Y為有機官能團。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，這些基團水解時即生成硅醇(Si(OH)₃)，而與無機物質結合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、環氧基、甲基丙烯酰氧基、巰基。這些反應基團可與有機物質反應而結合。因此，通過使用硅烷偶聯劑，可在無機物質和有機物質的界面之間架起“分子橋”，把兩種性質懸殊的材料連接在一起提高復合材料的性能和增加粘接強度的作用。通過修飾抗體可實現表面功能化，形成特異性免疫探針，再封閉多余的活性位點。由于納米Fe-Ni-Co合金探針具有順磁特性，因此，可以通過外加磁場分離沒有聯上的抗體。納米Fe-Ni-Co合金材料修飾的是第1抗體的抗體，即2抗。3.?將目標菌特異性第1抗體采用一定的方法固定在固相載體表面，并將多余活性位點封閉備用。4.?在第1步處理過的樣品，加入第2步制得的順磁納米Fe-Ni-Co合金探針，充分混合震蕩反應一段時間，抓取目標菌后施加外加磁場，由于納米Fe-Ni-Co合金具有順磁特性，Fe-Ni-Co合金探針會聚集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出探針。若待檢樣本中有目標菌，則首先會在第1步時與1抗形成1抗復合物，1抗復合物會再與探針表面的2抗復合，通過外加磁場而被富集、分離。洗滌、磁分離后加少量無菌的去離子水則形成目標菌的順磁納米Fe-Ni-Co合金探針懸濁液。此時，抓到目標菌和未抓到目標菌的過量探針還是混在一起。5.?將上述混在一起的探針，加到第3步的固相載體表面，則抓取了目標菌的探針將與固相載體表面單克隆抗體發生特異性結合，形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗可以將未發生結合的探針洗脫。6.?再采用洗脫劑將固定載體上的結合的特異性納米免疫探針洗下來，用磁分離的方法清洗掉離子、溶劑。此部分探針如果存在，就是抓取了目標菌的探針。由于Fe-Ni-Co合金具有順磁特性，對于共振儀器非常敏感，相對于其他分子而言，微量的Fe-Ni-Co合金能夠大幅降低無菌的去離子水的自旋-晶格馳豫參數T1和自旋-自旋弛豫時間T2，而無菌的去離子水在一定的均勻場強下，T1/T2是固定的。將洗脫液置于核磁共振儀中，與無菌的去離子水對照組進行對照。顯著發生T1/T2值降低的說明有探針存在，從而間接說明食品樣品中有致病菌檢出。探針含量與T1/T2值降低呈正比。通過加標，可以定量檢測目標菌。該方法中Fe-Ni-Co合金探針既是分離富集的手段，同時Fe-Ni-Co合金具有的順磁特性，又可作為定量檢測的探針。該方法的主要優點就是快速、靈敏度高。相對于致病菌的微生物培養2-3天甚至幾天的時間。此方法主要取決于樣品的預處理時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。所有的食品標準，致病菌都不得檢出。因此，用該方法可做大規模待檢樣本的陽性篩選，一定程度上可以定量檢測。目前，國內外還沒有文獻報道這種方法。

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發明內容

一種基于順磁納米Fe-Ni-Co合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，用于對各種不同的食品樣品進行評價。該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時間。

一種基于順磁納米Fe-Ni-Co合金探針間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，利用核磁共振儀對順磁物質的響應敏感性，提出核磁共振弛豫參數變化與Fe-Ni-Co合金納米粒子順磁免疫探針含量的相關性指標。不同的致病菌檢出下限不同。