[發(fā)明專(zhuān)利]一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310093869.0
• 申請(qǐng)日: 2013-03-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103146847A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陶小榮;李靖玉;衛(wèi)其巍;張?chǎng)┠?/a>;吳鑒艷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 南京天華專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及西瓜、黃瓜和葫蘆等葫蘆科植物上黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測(cè)技術(shù)及其在病害診斷上的應(yīng)用，具體涉及一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber?green?mottle?mosaic?virus，CGMMV）屬番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）、煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）成員。該病嚴(yán)重為害葫蘆科作物，為我國(guó)的檢疫性有害生物。黃瓜綠斑駁花葉病毒苗期染病幼苗頂尖部的2～3片葉子現(xiàn)亮綠或暗綠色斑駁，葉片較平，產(chǎn)生暗綠色斑駁的病部隆起，新葉濃綠，后期葉脈透化，葉片變小，引起植株矮化，葉片斑駁扭曲，呈系統(tǒng)性傳染。瓜條染病現(xiàn)濃綠色花斑，有的也產(chǎn)生瘤狀物，致果實(shí)成為畸形瓜，影響商品價(jià)值，嚴(yán)重的減產(chǎn)25%左右。自然界主要侵染甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜及瓠瓜等多種葫蘆科作物，通過(guò)種子和土壤傳播，此外也可通過(guò)汁液，農(nóng)事操作及葉片接觸等方式進(jìn)行傳播。帶毒種子傳播是該病毒遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。

該病自1935年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，曾先后在英國(guó)、德國(guó)、丹麥、荷蘭、俄羅斯、印度、日本、韓國(guó)以及我國(guó)臺(tái)灣發(fā)生并造成嚴(yán)重危害。黃瓜綠斑駁病毒病以前在我國(guó)大陸沒(méi)有發(fā)生記載，2006年國(guó)內(nèi)個(gè)別地方發(fā)現(xiàn)西瓜綠斑駁病毒病，2006年12月份中國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布788號(hào)公告，將其列為全國(guó)植物檢疫性有害生物。

目前在植物病毒鑒定識(shí)別上常采用的方法有：生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，血清學(xué)檢測(cè)，電鏡觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。由于傳統(tǒng)的植物病毒監(jiān)測(cè)方法，如電鏡觀察、傳統(tǒng)的生物學(xué)接種鑒定等這些方法很難分別出是否是黃瓜綠斑駁花葉病毒，因此需要一個(gè)快速準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)該病毒。環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP），是由Notomi?等在2000年發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，他是一種高靈敏度的鏈置換技術(shù)，一種新型的PCR替代技術(shù)。LAMP特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了4個(gè)特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶—Bst?DNA?polymerase?在恒溫的條件下反應(yīng)60min就可以完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)熒光染色后在紫外光下觀察可以清晰的觀察到反應(yīng)結(jié)果。不需要長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)，不需要昂貴的PCR儀，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過(guò)程。目前已廣泛應(yīng)用于人類(lèi)和動(dòng)植物各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等引起的疾病監(jiān)測(cè)和快速診斷。但是，目前尚沒(méi)有將RT-LAMP技術(shù)應(yīng)用在黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的檢測(cè)上。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于黃瓜綠斑駁花葉病毒快速檢測(cè)的RT-LAMP引物組。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明又一目的在于提供一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法。該方法用于快速檢測(cè)西瓜、黃瓜和葫蘆等葫蘆科上黃瓜綠斑駁花葉病毒，通過(guò)該方法可以快速診斷出疑似病株是否攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種用于黃瓜綠斑駁花葉病毒快速檢測(cè)的RT-LAMP引物組，其在于所述的RT-LAMP引物組包含一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，所述外引物對(duì)F3、B3的序列分別為SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示，所述內(nèi)引物對(duì)FIP、BIP的序列分別為SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示。

上述的引物組在制備黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

一種含有上述的引物組的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒。

上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒，其在于所述的試劑盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反應(yīng)液、DEPC水和熒光染料SYBR?GreenⅠ檢測(cè)液組成的檢測(cè)體系。