[發明專利]小鼠β-actin的cDNA序列的熒光定量PCR檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201310092572.2
• 申請日: 2013-03-21
• 公開（公告）號: CN103173553A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 李波;苗玉發;霍艷;周曉冰;耿興超;王三龍
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種小鼠β-actin的cDNA序列的熒光定量PCR檢測試劑盒，屬于小鼠β-actin的cDNA的定量檢測領域。

背景技術

β-actin即β肌動蛋白，是actin家族的一員，在維持細胞結構，細胞內運動，細胞分裂等細胞生理活動方面發揮著重要的作用。β-actin基因是應用較為廣泛的管家基因之一。管家基因(house-keeping?genes)是指所有細胞中均要表達的一類基因，其產物是對維持細胞基本生命活動所必需的。在進行定量PCR時，可以通過計算目的基因和管家基因的比值，得到基因表達的相對濃度。

迄今為止，用于檢測小鼠β-actin的cDNA序列的熒光定量PCR試劑盒均不同程度的存在特異性差、靈敏度低、檢測線性范圍較窄等缺陷，有待改進。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種能夠準確的定量小鼠β-actin的cDNA序列表達量的熒光定量PCR檢測試劑盒，該檢測試劑盒具有特異性強、靈敏度高、檢測線性范圍廣等優點。

本發明的主要目的是通過以下技術方案來實現的：

小鼠β-actin的cDNA序列的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括以下各組分：熒光聚合酶鏈式反應液，特異性引物對，熒光標記的探針和滅菌水二所述的特異性引物對由SEQ?ID?No．1和SEQ?ID?No．2所示的引物組成；所述的探針的核苷酸序列為SEQ?ID?No．3所示。

其中，在探針的5’端標記有熒光報告基團，所述的熒光報告基團是FAM、HEX或ROX熒光報告基團，優選為FAM熒光報告基團；在探針的3’端標記有熒光淬滅基團；所述的熒光淬滅基團可以是TAMRA、BHQl或BHQ2等熒光淬滅基團，優選為TAMRA熒光淬滅基團。

其中，所述的熒光聚合酶鏈式反應液包括：Taq?DNA聚合酶、PCR緩沖液、Mg²⁺、dNTPs；

為了達到絕對定量的結果，所述的試劑盒中還包含有小鼠β-actin的cDNA序列陽性質粒標準品；本領域技術人員可以按照常規方法自行構建得到小鼠β-actin的cDNA序列陽性質粒標準品，例如：在pUC57質粒的Sam?I酶切位點插入SEQ?ID?No．4所示的基因片段，即得到小鼠β-actin的cDNA序列陽性質粒標準品；也可通過商業途徑購買得到小鼠β-actin的cDNA序列陽性質粒標準品。

本發明試劑盒中各組分的用量可根據待檢測樣品的數量以及每次熒光定量PCR反應所需的用量來確定或進行相應的調整，這些都是本領域所屬技術人員視檢測情況或實際需要很容易就能確定的參數。

作為參考，采用本發明熒光定量PCR試劑盒檢測小鼠β-actin的cDNA序列的PCR反應條件和PCR反應體系如下：

PCR反應體系：總體積25μl，上／下游引物260nmol／L，探針100nmol／L，5×PCR緩沖液5ul，dNTP200gmol／L，Mg²⁺3mmol／L，Ex?TaqHS聚合酶1．5U，模板1．5μl，滅菌水16μl。

PCR擴增條件：94℃3min；94℃30s，60℃lmin，40個循環。

本發明試劑盒需采用各種市售的熒光定量PCR儀進行分析和檢測，所述的熒光定量PCR儀可以是ABI系列熒光定量PCR儀、BIORAD?iCycler、Roche4800、Qiagen?Rotor?Gene等。

本發明試劑盒對檢測樣本的要求：

檢測樣本來源：小鼠血液和組織臟器中基因組DNA.

樣本制備：

(1)小鼠血液中DNA的提取，或組織臟器中DNA的提取可以按照市售DNA提取試劑盒說明書操作，也可以按照以下提供的方法操作：

(2)稱取約25mg左右的組織臟器，去除結締組織，用剪刀剪成細小碎塊。加10倍體積DNA提取緩沖液[50mM?Tris?C1(pH8.0)，0．1MEDTA(pH8．0)，0．1M?NaCl]，用超聲勻漿儀進行勻漿。取200μ1勻漿液于2ml的Eppendorf管中，緩慢加入20％SDS溶液，至終濃度1％，搖勻直至溶液變粘稠。再加入5μl蛋白酶K，55℃消化2-3h或過夜。并間歇攪動?；蛉?00μl?EDTA抗凝的全血，加入5μ1蛋白酶K，55℃消化2-3h或過夜。

(3)取出勻漿液，放置室溫，加入50μl5M的NaCl至終濃度為1M。再加等體積飽和酚抽提，以12,000rpm離心5min。