[發明專利]一種苯胺綠人工抗原的制備方法

無效

• 申請號: 201310092348.3
• 申請日: 2013-03-22
• 公開（公告）號: CN103204924A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 沈海英;徐建明
• 申請（專利權）人: 杭州宏泰生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;G01N33/53
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 俞潤體;沈相權

1.一種苯胺綠人工抗原的制備方法，其特征在于按以下步驟進行：

(1)?、制備人工半抗原---半抗原4-MGC?的合成:

?　　(a)、?將質量摩爾比為2:1的N,N-?二甲基苯胺和4-?羧基苯甲醛加入到圓底燒瓶中，N,N-?二甲基苯胺為3g，在溫度為100℃下攪拌反應6小時，形成反應液；反應結束后反應液用乙醚提取，轉干，經重結晶后得到白色固體產物Ⅰ；

?????(b)、?在產物Ⅰ中加入苯30ml以及催化量Amberlyst?15?resin一起放入圓底燒瓶中，在氮氣的保護下,在溫度為130℃下進行回流攪拌過夜，形成溶劑；反應結束后，將溶劑減壓后轉干，用乙醚提取得到產物Ⅱ;?

?????(c)、?將產物Ⅱ經硅膠柱層析純化后,提取得到半抗原4-MGC的白色固體；

(2)?、制備苯胺綠人工抗原---苯胺綠-BSA的合成:

?　　(d)、?稱取0.425g?的半抗原4-MGC和0.225g?的N-?羥基琥珀酰亞胺溶于

10.0ml的N,N-?二甲基甲酰胺中,存放于燒杯中,再將溶解了0.255g?N，N-?二環己基碳二亞胺的10.0mlN,N-?二甲基甲酰胺的溶液慢慢滴加,邊滴加邊磁力攪拌,攪拌結束后在溫度為20℃下進行磁力攪拌過夜,得到A液；

????(e)?、將牛血清蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液；

(f)?、在常溫磁力攪拌條件下,將A液逐滴加入到裝有10ml的B液中,得到人工抗原混合液，在溫度為4℃的冰箱內進行磁力攪拌過夜;

????(g)、?制備鈉離子濃度為0.1mol/L的PBS緩沖液，pH為7.2～7.4；

????(h)、?將人工抗原混合液于PBS緩沖液中進行透析，在溫度為4℃下進行攪拌透析,每4小時換一次PBS緩沖液,透析時間為2天，形成透析液,?紫外掃描透析液無小分子吸收峰時,將產物離心取上清,在無菌條件下通過0.2μm?的濾膜，即得到人工抗原：苯胺綠-牛血清蛋白。