[發明專利]檢測表皮生長因子受體19、21外顯子突變的引物探針體系、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201310092075.2
• 申請日: 2013-03-21
• 公開（公告）號: CN103233064A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 陳曉琦;樊青霞;趙亞敏;鄭玉玲;王峰
• 申請（專利權）人: 陳曉琦
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州金成知識產權事務所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

1.一種檢測表皮生長因子受體19、21外顯子突變的引物探針體系，包括如下擴增EGFR?19外顯子E746～A750del突變和EGFR?21外顯子L858R突變的不對稱PCR引物，以及與其引物相匹配的3WJ探針：

。

2.一種檢測表皮生長因子受體19、21外顯子突變的方法，包括如下步驟：

（1）按常規方法進行待測樣品處理；

（2）PCR擴增：以權利要求1所述的檢測19?DEL的上游引物A和下游引物B形成如下不對稱PCR體系擴增EGFR19外顯子E746～A750del：

5×buffer????????????????????????????????????????????10微升

25毫摩的MgCl₂??????????????????????????????????2.5微升

10毫摩的dNTP???????????????????????????????????1微升

10微摩的上游引物A????????????????????????????3微升

10微摩的下游引物B???????????????????????????0.2微升

500個單位的Taq?DNA?Polymerase???????0.3微升?

ddH₂O???????????????????????????????????33微升

總計?????????????????????????????????????50微升

PCR擴增條件為：

以權利要求1所述的檢測L?858R的上游引物A＇、下游引物B＇對應的替換上述不對稱PCR體系中的上、下游引物，所形成的不對稱PCR體系按同樣的PCR擴增條件擴增21外顯子L858R；

（3）3WJ檢測：分別向上步所得兩種產物中直接加入10ul相對應的探針體系濃縮液，分別形成60微升的3WJ探針體系含：

10×Buffer??????????????????????????????6微升

100×BSA??????????????????????????????0.6微升

10微摩的探針A或A＇?????????1.2微升

10微摩的探針B或B＇??????????1.2微升

ddH₂O?????????????????????????????????????51微升

3WJ條件為：37℃孵浴20min，95℃5min終止反應檢測熒光；

（4）結果判斷：如有熒光產生，則存在著對應的外顯子突變。

3.一種檢測表皮生長因子受體19、21外顯子突變的試劑盒，至少包括如下試劑：

（1）形成權利要求2所述擴增EGFR19外顯子E746～A750del的不對稱PCR體系所需要的2mM?Mg²⁺、200nM?dNtP、300nM?上游引物、30nM下游引物、Taq酶，以及形成其所對應的3WJ探針體系所需要的1×BSA、限制內切酶、探針A和探針B；

（2）形成權利要求2所述擴增21外顯子L858R的不對稱PCR體系所需要的2mM?Mg²⁺、200nM?dNtP、300nM?上游引物、30nM下游引物、Taq酶，以及形成其所對應的3WJ探針體系所需要的1×BSA、限制內切酶、探針A＇和探針B＇。