[發(fā)明專利]一種HSD11B1基因的原位雜交的探針制定及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310091240.2
• 申請日: 2013-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN103320505A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章文羿;李江超;陳東海;李晶;崔航
• 申請（專利權(quán)）人: 北京安必奇生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
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1.一種HSD11B1基因mRNA原位雜交的探針，其特征在于，該探針的序列為：

5’CGAGTTCAAGGCAGCGAGACACTACCTTCTGGAGACC???3’。

2.一種如權(quán)利要求1所述探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于：

(1)根據(jù)HSD11B1的Gene?bank序列設(shè)計(jì)HSD11B1特異的探針序列；

(2)合成HSD11B1的mRNA原位雜交的探針，并將探針標(biāo)記上地高辛；

(3)檢測HSD11B1的mRNA探針的原位雜交

3.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進(jìn)行：

(a)按照步驟(1)設(shè)計(jì)的序列合成探針；

(b)將探針用HPLC純化；

(c)將純化后的產(chǎn)物標(biāo)記上非放射性標(biāo)記物-地高辛。

4.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進(jìn)行：

(a)將小鼠用0.4％戊巴比妥鈉深麻后，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速?zèng)_洗去除血液，再以4％多聚甲醛灌注固定；所述的0.01mol/L?DEPC-PBS是2.9克磷酸氫二鈉，0.29克磷酸二氫鈉，9.0克氯化鈉用超純水定容至1L后，再加入體積百分比為0.1％的DEPC1ml放置過夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4％的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L?PB緩沖液定容至1000ml；所述0.2mol/L?PB緩沖液是用29.01克磷酸氫二鈉，2.96克磷酸二氫鈉加超純水定容至500ml配制而成；

(b)取材后進(jìn)行組織的后固定：于4℃，用4％的多聚甲醛后固定24小時(shí)；

(c)將固定好的組織進(jìn)行切片：將組織切成25～30μm組織切片，并將切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC-PBS中，放于4℃冰箱備用；

(d)將切好的組織片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次，室溫，每次5-10分鐘；

(e)將上述清洗過的片子用5x?SSC清洗2次，室溫，每次5-10分鐘；所述5x?SSC是由20xSSC用超純水稀釋的，20x?SSC為一種檸檬酸緩沖液；

(f)將5x?SSC清洗后的組織片浸入預(yù)雜交液中，于55℃，在雜交爐孵育1-2小時(shí)；所述預(yù)雜交液是由5ml的去離子甲酰胺，2.5ml的20x?SSC溶液，200μl的50x?Denhardt’s溶液，50μl的濃度為200mg/ml的Heparin溶液，100μl的濃度為10mg/ml的tRNA溶液，100μl的濃度為10％的CHAPS溶液，100μl的濃度為10％的Tween-20溶液，100μl的濃度為0.5mol/L的pH8.0的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H2O混合配制而成；所述50x?Denhardt’s為一種常用的雜交試劑；所述200mg/ml的Heparin為200mg的Heparin粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成；所述10mg/ml的tRNA為10mg的tRNA粉末溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成；所述10％的CHAPS為1g的CHAPS溶于1ml的DEPC-H2O中配制而成；所述10％的Tween-20為100μl的Tween-20溶于900μl的DEPC-H2O中配制而成；所述0.5mol/L的pH8.0的EDTA為186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉加入800ml的DEPC-H2O中在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)pH值至8.0然后定容至1L配制而成高壓滅菌備用；所述DEPC-H2O為1L超純水加入體積百分比為0.1％的DEPC1ml，放置過夜并高壓滅菌處理后的水；

(g)將預(yù)雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55℃，在雜交爐中孵育16-20小時(shí)；

所述雜交液是上述預(yù)雜交液中加入終濃度為1.0ug/ml的mRNA探針配置成的；

(h)雜交后用1x?SSC洗滌雜交的組織切片，37℃，2次，每次10分鐘；

(i)用2x?SSC洗滌上述的組織切片，37℃，2次，每次10-15分鐘；

(j)用10ug/ml的RNase?A處理，37℃，1次，每次30-40分鐘；

(k)用2x?SSC洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；

(1)用0.01mol/L?PBS洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；所述0.01mol/L?PBS是2.9克磷酸氫二鈉，0.29克磷酸二氫鈉，9.0克氯化鈉用超純水定容至1L配置的磷酸

緩沖液；

(m)按1∶2000的抗體效價(jià)，在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體，對洗滌后的組織切片進(jìn)行孵育，室溫，放置過夜；

(n)將經(jīng)過上步抗體孵育的組織片用0.01mol/L?PBS洗滌，于室溫，清洗3次，每次10-15分鐘；

(o)用TS9.5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述TS9.5為是由終濃度為摩爾濃度為0.1mol/L?Tris-HCl(PH9.5)，摩爾濃度為0.1mol/L?NaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/LMgCL2用超純水配制而成；

(p)將上述切片放于NBT-BCIP反應(yīng)液中避光孵育4～6小時(shí)，在此過程中觀察切片呈色強(qiáng)度；所述NBT-BCIP是一種Roche公司生產(chǎn)的呈色反應(yīng)液；

(q)當(dāng)呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘；

(r)將上述洗滌后切片表于載玻片上；

(s)晾干切片，再經(jīng)過二甲苯脫色，復(fù)染核固紅，封片，以備觀察。