[發明專利]檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201310091146.7
• 申請日: 2013-03-21
• 公開（公告）號: CN103592434A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 徐華莉;李亮;張明洲;王旻子;魏建良;程曄
• 申請（專利權）人: 杭州迪恩科技有限公司
• 主分類號: G01N33/544
• 分類號: G01N33/544;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于免疫檢測技術領域，具體涉及檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法及其試劑盒。

背景技術

β興奮劑是一種人和獸醫作為治療哮喘的藥物。在牲畜中超劑量使用可以將牲畜的脂肪組織轉化為肌肉組織，由于能夠顯著改善脂肪率和生產效率，β興奮劑往往被濫用于畜牧養殖生產中。近年來已經有沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林中毒的病例報道。

在β興奮劑中，沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林毒性較大，檢測這些物質一般將沙丁胺醇與載體合成抗原或半抗原，免疫動物，獲得多克隆抗體，可與其他β興奮劑有交叉反應，進而也可以檢測其他β興奮劑，但是，目前，尚沒有一種可以同時檢測沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林這7種β興奮劑的異性抗體。

傳統的試劑盒檢測用顯色劑一般將它調配成A、B兩種液體，當需要顯色時就分別加入A和B液，當混合液與實驗中復合物反應就會產生顯色效果。A液一般由PBS緩沖液、檸檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、過氧化氫組成，B液一般由PBS緩沖液、檸檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、硫代硫酸鈉組成；使用時需要將兩種液體按比例混合后才能使用，且兩種液體都需要避光保存，使用起來比較麻煩。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒。

本發明的目的還在于提供一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測的方法。

一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，該試劑盒包括：β-興奮劑特異性抗體、包被有β-興奮劑特異性抗體的酶標板、β-興奮劑辣根過氧化物酶標記物、克倫特羅標準品、酶標物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和濃縮樣品稀釋液。

所述顯色劑為過氧化氫或過氧化脲，鄰苯二胺或四甲基聯苯胺與穩定劑K按體積比5∶5∶1混合而成的溶液，穩定劑K、含酶穩定劑AH和酶保護劑均購自美國International?Diagostica?System公司。

所述的酶標物稀釋液為含酶穩定劑AH和酶保護劑KEN的磷酸鹽緩沖液。

所述的終止液為2mol/L的鹽酸溶液。

所述的濃縮樣品稀釋液為含1％BSA的5倍濃縮磷酸鹽緩沖液。

所述β-興奮劑特異性抗體是以特異免疫原免疫動物制得，所述特異免疫原是將克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅和西布特羅通過戊二醛法交聯到載體蛋白上制成。

所述載體蛋白為多聚賴氨酸、牛血清白蛋白、雞丙種球蛋白、人血丙種球蛋白或卵清蛋白。

所述動物為兔、鼠或羊。

9、一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法，其特征在于，按照如下步驟進行：

(1)將試劑于盒外充分恢復至室溫，恢復時間為1-5小時；

(2)預先進行編號，標記B₀、標準品和樣品的位置，進行雙孔檢測；

(3)從包被有β-興奮劑特異性抗體的酶標板上取下所需數量的微孔，將

多余的微孔重新密封并放回2～8℃保存；

(4)將酶標物、濃縮樣品稀釋液、清洗液根據稀釋倍數用蒸餾水配制成工作液；

(5)在B₀孔中加入50μL0.0ng/mL標準品溶液，在各標準孔中加入50μL的標準品溶液，在各樣品孔中加入50μL樣品溶液；

(6)在所有孔中加入100μL的酶標物，晃動反應1-10s，室溫下孵育30min；

(7)倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿清洗液，用微量移液器在每個微孔中加入100μL顯色劑，晃動酶標板使之混勻；

(8)室溫下顯色10min，每孔中加入100μL終止液，混勻；

(9)在450nm下檢測吸光度，分析計算檢測結果。