[發明專利]環糊精的檢測和定量

有效

• 申請號: 201310090503.8
• 申請日: 2005-12-05
• 公開（公告）號: CN103217500A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 佐蘭·索希奇;魯林·奎蘭;詹姆斯·埃亨;羅賓·姆哈特雷
• 申請（專利權）人: 比奧根艾迪克MA公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 上海勝康律師事務所 31263
• 代理人: 李獻忠

本申請是申請日為2005年12月5日，申請號為200580041782.2，申請人為比奧根艾迪克MA公司，名稱為“環糊精的檢測和定量”的專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及在含蛋白質的溶液中的環糊精以及環糊精衍生物的檢測和定量。本發明進一步涉及評估藥物制劑中的殘留環糊精的存在的方法。

背景技術

環糊精是一種環狀多糖，通常多由六個（α-環糊精）、七個（β-環糊精）或八個（γ-環糊精）葡萄糖單元組成，這些葡萄糖單元由α-1，4-葡萄糖苷鍵連接為環狀的環。這些葡萄糖單元形成椅式構象后，所有的仲羥基位于該環的一側，而所有的伯羥基基團均位于另一側。其結果是，其外部表面是親水的，從而使環糊精可水溶解。相反，環糊精的空腔是疏水的，因為它們由C₃和C₅原子的氫以及醚樣氧連接。這種結構允許環糊精與疏水化合物形成包合物（inclusion?complex）。基于該特性，環糊精廣泛地用于提高難水溶藥物的水溶性，加強藥物穩定性，并降低藥物的不期望出現的負作用。

該環糊精的羥基基團可以衍生，以改變分子的特性（例如：水溶性、結合特性）。甲基-β-環糊精（MBCD）是其中一種最常使用的環糊精衍生物。

環糊精也應用在細胞培養系統中以將疏水營養物，例如膽固醇，轉運入細胞中。環糊精對培養膽固醇營養缺陷型細胞特別有用，例如膽固醇營養缺陷型CHO細胞、COS細胞以及NSO細胞。當細胞培養被用來制備自然產生的蛋白質或重組蛋白質、特別是藥用蛋白質時，在純化的蛋白質產品中作為殘留的污染物存在的環糊精在藥物制備中成為一個問題。因此，需要一種靈敏和快速的技術，以檢測和定量含蛋白質溶液中的低水平的環糊精或環糊精衍生物。

Grosse等人（J.Chromatography?B694:219(1997)）披露了一種用于檢測MBCD的技術，該技術利用尺寸排除色譜法，并采用一種可與MBCD形成包合物的熒光團（1-萘酚），從而允許對該包合物的熒光檢測。該技術被設計為用來檢測血漿樣本中的MBCD，以用作藥物動力學研究，其需要在運用色譜法之前，在流動相中利用有機溶劑萃取樣本,蒸發和溶解殘留物。Gage等人（J.Pharm.Biomed.Analysis22:773(2000)）披露了一種利用1-萘酚，用于測量在血漿樣本中的硫代丁基醚-β-環糊精的類似技術。該方法需要在運用色譜法之前處理樣本，包括固相萃取、蒸發、以及溶解殘留物。這些技術不能達到從蛋白質組合物中分離環糊精的效果。

在本技術領域中，需要一種用于檢測蛋白質中環糊精或環糊精衍生物的存在的方法，優選地不需要樣本萃取步驟。

發明內容

因此，在一個方面，本發明提供了一種用于檢測在含蛋白質溶液中的環糊精或環糊精衍生物的存在的方法，該方法包括通過尺寸排除色譜法（SEC）從所述蛋白質中分離可能存在的任何環糊精或環糊精衍生物，將所述環糊精或環糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環糊精或環糊精衍生物形成可檢測的包合物，以及測量來自于所述包合物的信號的存在。

本發明的另一個方面，為一種用于確定在含蛋白質溶液中可能存在的環糊精或環糊精衍生物的量的方法，該方法包括通過SEC從所述蛋白質分離任何環糊精或環糊精衍生物，將所述環糊精或環糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環糊精或環糊精衍生物形成可檢測的包合物，測量來自于所述包合物的信號的存在，以及確定所述信號的大小，其中該信號的大小指示在該溶液中的環糊精或環糊精衍生物的量。

本發明的第三個方面，是一種評估藥物制劑的方法，該方法包括：

（a）提供一種包括藥用蛋白質和藥學上可接受的載體的藥物制劑；

（b）利用SEC分離所述藥物制劑；

（c）將可能存在于所述藥物制劑中的環糊精或環糊精衍生物與一種制劑相接觸，該制劑與分離的環糊精或環糊精衍生物形成可檢測的包合物；以及

（d）檢測來自于所述包合物的信號，其中該信號的大小指示在該制劑中的環糊精或環糊精衍生物的量。

在本發明的一個實施方式中，該環糊精或環糊精衍生物為MBCD。

在本發明的另一個實施方式中，該制劑為一種熒光團，例如，1-萘酚。該制劑可在由SEC進行分離之前、該分離期間或者分離后與該環糊精或該環糊精衍生物相接觸。

在一個實施方式中，該溶液或藥物制劑的樣本可不作任何準備地被裝載于該SEC柱上，例如，該樣本不需利用有機溶劑進行萃取、干燥、再懸浮、濃縮或其它改變。

附圖說明